唐 遠，何沐陽，陸永躍*

(1. 廣西梧州市植物保護站，廣西梧州543003；2. 華南農(nóng)業(yè)大學昆蟲學系，廣州510642)

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棉花粉蚧對木爾坦棉花曲葉病毒的獲取、存留和傳播風險

唐 遠1,2，何沐陽2*，陸永躍2**

(1. 廣西梧州市植物保護站，廣西梧州543003；2. 華南農(nóng)業(yè)大學昆蟲學系，廣州510642)

為明確棉花粉蚧Phenacoccussolenopsis對扶桑Hibiscusrosa-sinensis感染的木爾坦棉花曲葉病毒(CLCuMV)的傳播風險，本文應(yīng)用PCR方法研究了棉花粉蚧獲取、存留和傳播CLCuMV的規(guī)律和能力。結(jié)果表明棉花粉蚧各取食危害蟲期均可獲取、攜帶CLCuMV，獲取病毒所需時間為2-48 h，蟲體內(nèi)病毒最多可存留312 h；但是，粉蚧體內(nèi)病毒無法侵染健康扶桑，亦不會經(jīng)卵或者交配進行垂直和水平傳播。本研究證明了棉花粉蚧不能傳播CLCuMV，為防治該蟲、該病毒病提供了依據(jù)。

棉花粉蚧；木爾坦棉花曲葉病毒；傳播風險

棉花粉蚧PhenacoccussolenopsisTinsley又名扶桑綿粉蚧，原產(chǎn)于美國(Williams and Granara De Willink，1992)，為近年新入侵我國的一種重要害蟲(武三安和張潤志，2009)。該蟲1990年代在世界范圍內(nèi)開始擴散危害(陸永躍等，2008)，2005-2006年以來曾對印度和巴基斯坦棉區(qū)造成嚴重危害，使棉花減產(chǎn)50%，損失巨大(Wangetal.，2010; Kumaretal.，2014)。該蟲寄主范圍廣，繁殖速度快、潛力大，可隨植物及其包裝物、載體、介質(zhì)等調(diào)運進行遠距離傳播(陸永躍等，2008；Wangetal.，2010；胡婕等，2014)。自2008年我國發(fā)現(xiàn)棉花粉蚧以來，截至2015年全國已有15個省份報道其發(fā)生，且仍在不斷擴散蔓延中。我國雖未報道棉花粉蚧對棉花造成明顯危害，但風險分析表明該蟲對我國棉花產(chǎn)業(yè)潛在威脅巨大(王艷平等，2009；Wangetal.，2010；馬駿等，2011)。

植物生長過程中會遭受多種病原物侵染，由此產(chǎn)生的植物病害導致世界范圍內(nèi)農(nóng)業(yè)損失達10%-30%(Williams and Herman，2012)。由病毒侵染導致的植物病毒病為其中一類較為嚴重的病害，通常難以防治(史曉斌等，2012)。大部分植物病毒可由昆蟲作為介體傳播(Power，2000)，如煙粉虱傳播雙生病毒引起多種曲葉病(衛(wèi)靜等，2015)，褐飛虱可傳播水稻矮縮病毒Ricedwarfvirus(Chenetal.，2011)等。木爾坦棉花曲葉病毒(CLCuMV)是引發(fā)棉花毀滅性病害—棉花曲葉病的一種主要病原之一，主要經(jīng)介體昆蟲攜帶傳播(何自福等，2010)。2006年我國就發(fā)現(xiàn)了CLCuMV，雖然目前尚未在我國棉花上檢測到，但其已侵染了華南地區(qū)重要園林植物—扶桑Hibiscusrosa-sinensis，導致了黃化曲葉病，并且發(fā)生分布已經(jīng)較為普遍(林林等，2011；唐遠和陸永躍，2013)。扶桑上該病毒的分離物可成功侵染棉花，被侵染棉花表現(xiàn)曲葉病典型癥狀(何自福等，2010)。扶桑是棉花粉蚧的主要嗜食寄主之一，棉花粉蚧可在感染木爾坦棉花曲葉病毒的扶桑上發(fā)生危害。研究表明多種粉蚧可傳播病毒，其中榕臀紋粉蚧Planococcusficus、桔臀紋粉蚧Planococcuscitri、擬長尾粉蚧Pseudococcusaffinis、柑橘棲粉蚧Pseudococcuslongispinus和長尾粉蚧Pseudococcuscalceolariae等皆可傳播葡萄卷葉病毒(潘志勇和翟衡，2001)。作為我國棉花產(chǎn)業(yè)潛在危害極大的入侵害蟲，棉花粉蚧是否會攜帶、傳播木爾坦棉花曲葉病毒?解釋此問題將對防治棉花曲葉病有重要價值，亦對準確把握和定位棉花粉蚧的危害有指導作用。本文采用分子生物學方法研究了棉花粉蚧對CLCuMV的獲取、存留和傳播，明確了該蟲傳播該病毒的風險。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1供試蟲源

在華南農(nóng)業(yè)大學昆蟲學系檢疫與入侵害蟲實驗室人工氣候箱里(28℃±1℃，RH 60%-65%，光照周期(L ∶D)14 h ∶10 h)，以扶桑為寄主飼養(yǎng)、建立種群，實驗時選取各齡健康蟲態(tài)備用。

1.1.2供試寄主

扶桑幼苗種植于室內(nèi)(溫度28℃±1℃，RH 60%-65%)塑料花盆(直徑20 cm，高30 cm)中，常規(guī)管理，不使用任何農(nóng)藥防治病蟲害，實驗時選取約35 cm高健壯植株備用。

1.1.3感染CLCuMV的扶桑

染病扶桑樣品采自于廣州華南農(nóng)業(yè)大學校園五山學生公寓周圍綠化帶，經(jīng)病毒分子序列測定后確認攜帶有CLCuMV的扶桑標記為病毒來源植株。

1.1.4主要實驗試劑

氯仿、異戊醇、異丙醇、無水乙醇均為分析純，購自于廣州化學試劑廠；Tris-Cl、NaCl、EDTA、Taq酶、dNTPs、PCR buffer、DNA marker DL2000、瓊脂糖等購自于寶生物工程(大連)有限公司；蛋白酶K購自于天根生化科技(北京)有限公司；檢測所用引物于生工生物工程(上海)股份有限公司合成；48%吡蟲啉懸浮劑購自于陜西美邦農(nóng)藥有限公司，兌水配成3%水溶液備用。

1.1.5主要實驗儀器

梯度PCR擴增儀Mastercycle Pro、高速冷凍離心機Eppendorf 5417R，德國艾本德股份公司；電泳儀BG-subMIDI，北京百晶生物技術(shù)有限公司；凝膠成像系統(tǒng)BIO-RAD Gel Doc XR，美國BIO-RAD 公司；超凈工作臺SIV-CI-ZFD，廣州深華科技有限公司；低溫冰箱ULT Freezer，美國Thermo Forma公司；恒溫培養(yǎng)箱DHP-9162，上海一恒科技儀器有限公司；滅菌鍋HV-110，日本HIRAYAMA公司；電子天平ALC-1100.2，珠海天創(chuàng)儀器有限公司；智能人工氣候箱RXZ，寧波江南儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1扶桑及棉花粉蚧DNA提取

在溫碩洋和何曉芳(2003)的方法基礎(chǔ)上進行一些修改(唐遠和陸永躍，2013)。取單頭粉蚧(1齡若蟲取10頭)放入1.5 mL離心管，先加入6 μL STE(100 mM NaCl；10 mM Tris-Cl，pH8.0；1 mM EDTA，pH8.0)，研磨勻漿，加入54 μL STE清洗研磨杵，再加入6 μL蛋白酶K(200 μg/mL)，研磨液在56℃恒溫器中消化2 h，消化后的產(chǎn)物在95℃孕育45 s，14000 r/min離心1 min沉淀殘渣，上清液作為做PCR的模板或保存在-20℃冰箱中備用。

1.2.2CLCuMV的PCR擴增

根據(jù)CLCuMV的DNA-A區(qū)域來設(shè)計特異引物，預期擴增長度為580 bp(唐遠和陸永躍，2013)(表1)。

表1　CLCuMV特異引物MJ-r及MJ-f的堿基序列

擴增體積為25 μL：含模板DNA(扶?？侱NA)1 μL，20 μmol/L正向引物和反向引物各1 μL，2.5 mM dNTP混合液2 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，10×buffer(含鎂離子)2.5 μL，無菌雙蒸水17.3 μL。

擴增條件：94℃預變性4 min；94℃ 45 s；56℃ 45 s；72℃ 1 min；擴增35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴增反應(yīng)結(jié)束后，取PCR特異性擴增產(chǎn)物5 μL在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測(電壓72 V，電泳緩沖液為1×TAE)，紫外燈下觀察結(jié)果，以明確目的基因的存在與否及擴增片段的大小。

1.2.3棉花粉蚧獲取木爾坦棉花曲葉病毒時間的測定

將100頭棉花粉蚧3齡若蟲饑餓12 h后，置于已放有6片染病扶桑幼嫩葉片的培養(yǎng)皿(Φ15 cm)中，用保鮮膜封好皿口，用昆蟲針在膜上扎出100個小孔供空氣流通，放入人工氣候箱(溫度28℃±1℃，相對濕度60%-65%)中培養(yǎng)。以在健康植株上取食的粉蚧為對照。于接蟲后0、1、2、4、8、12、24、48 h分別從皿中隨機取10頭粉蚧，置于-40℃保存，用于單頭粉蚧CLCuMV的PCR檢測，試驗重復3次。

粉蚧帶毒率(%)=(檢測到攜帶CLCuMV DNA的粉蚧個體數(shù)量/被檢測的所有粉蚧個體數(shù)量)×100。

1.2.4棉花粉蚧體內(nèi)CLCuMV存留時間的測定

1.2.3試驗結(jié)果證實取食帶病毒葉片48 h后3齡粉蚧帶病毒率為100%。取已飼毒48 h的3齡若蟲250頭，接到4株經(jīng)PCR檢測無CLCuMV的健康扶桑上，并用防蟲籠隔離，在室內(nèi)條件下飼養(yǎng)。于接蟲后0、12、24、36、48、72、96、120、168、240、312、360、480 h分別隨機取10頭粉蚧，置于-40℃保存，并用PCR檢測單頭粉蚧CLCuMV。重復2次。

1.2.5棉花粉蚧傳播CLCuMV能力的檢測

關(guān)于粉蚧傳毒研究發(fā)現(xiàn)飼毒24 h的10頭葡萄粉蚧對寄主的接種停留時間(inoculation access period，IAP)24 h時對GLRaV-3傳毒率為100%(Tsaietal.，2010)，飼毒24 h的15頭煙粉虱對寄主的IAP達24 h后對TYLCV傳毒率也為100%(Mansour and Al-Musa，1992)。因此，本試驗將已飼毒48 h的棉花粉蚧3齡若蟲200頭接種在10株經(jīng)PCR檢測無CLCuMV的健康扶桑苗的幼嫩部位上，每株接種20頭，接種后用防蟲籠隔離飼養(yǎng)。接種停留時間為48 h后將植株上粉蚧全部移除，并噴灑3%吡蟲啉液處理植株，然后隔離觀察扶桑葉片是否產(chǎn)生由CLCuMV引起的癥狀，并在15 d后采集植株嫩葉檢測CLCuMV。

1.2.6棉花粉蚧不同齡期攜帶CLCuMV能力的檢測

1齡若蟲：選擇個體大小相近的棉花粉蚧1齡若蟲100頭，饑餓8 h，其他培養(yǎng)方法同1.2.3。由于1齡粉蚧個體微小，用單頭粉蚧提取到的DNA含量非常少，在常規(guī)PCR中難以擴增出條帶，因此在飼毒48 h后隨機取出10頭1齡粉蚧為一個樣品，放入2 mL的離心管中，置于-40℃保存，用PCR檢測粉蚧CLCuMV。重復5次。

2齡若蟲：選擇個體大小相近的棉花粉蚧2齡若蟲50頭，饑餓8 h，其他培養(yǎng)方法同1.2.3。飼毒48 h后隨機抽取5頭粉蚧放入2 mL的離心管中，置于-40℃保存，用PCR檢測單頭粉蚧CLCuMV。重復5次。

3齡若蟲、雌成蟲的處理方法同上。

1.2.7棉花粉蚧經(jīng)卵傳播體內(nèi)CLCuMV能力的檢測

選擇棉花粉蚧3齡末期若蟲20頭，饑餓8 h后，其他培養(yǎng)方法同1.2.3。每隔2 d更換一次病葉，等粉蚧蛻皮成為成蟲10 d后，將全部已飼毒粉蚧移至放有健康扶桑葉片的培養(yǎng)皿里繼續(xù)飼養(yǎng)，然后每天向培養(yǎng)皿里放入5頭雄蟲供交配，直至雌蟲產(chǎn)生卵囊以后。一是撥開卵囊，隨機挑取20粒卵放入2 mL離心管中，置于-40℃保存，用PCR檢測CLCuMV。重復5次。二是待1齡若蟲出現(xiàn)后隨機挑取10頭1齡若蟲放入2 mL的離心管中，置于-40℃保存，用PCR檢測CLCuMV。重復5次。

2　結(jié)果與分析

2.1棉花粉蚧獲取木爾坦棉花曲葉病毒時間

接毒后0 h、1 h后檢測到的棉花粉蚧帶毒個體數(shù)量均為0頭，接毒后2、4、8、12、24、48 h后檢測到的帶毒個體總數(shù)分別為2頭、12頭、19頭、25頭、27頭、30頭；由此，計算出接毒0、1、2、4、8、12、24、48 h后棉花粉蚧獲毒率分別為0、0、6.67%、40%、63.33%、83.33%、90%、100%(圖1)。飼毒2 h后就能從粉蚧體內(nèi)檢測到CLCuMV的存在，飼毒4 h后粉蚧的獲毒率明顯提高，上升到了40%；隨著飼毒時間增加，粉蚧獲毒率仍呈上升趨勢，到飼毒12 h后，獲毒率在80%以上，趨于穩(wěn)定；飼毒48 h，粉蚧獲毒率為100%。

圖1　扶桑綿粉蚧獲取木爾坦棉花曲葉病毒的時間Fig.1　Virus acquisition time for Phenacoccus solenopsis

2.2棉花粉蚧體內(nèi)CLCuMV的存留時間

從圖2可看出，脫離病毒侵染植株后短時間內(nèi)(0-24 h)棉花粉蚧若蟲帶毒個體比率較為穩(wěn)定，在95%以上；之后迅速降低，40 h后處于低水平穩(wěn)定階段，帶毒率在5%-15%。在棉花粉蚧體內(nèi)檢測到CLCuMV的最長時間為312 h，僅檢測到1頭粉蚧帶毒。

圖2　棉花粉蚧體內(nèi)CLCuMV的存留時間動態(tài)Fig.2　Retention time dynamic of ClCuMV in Phenacoccus solenopsis

圖3　不同處理時間棉花粉蚧體內(nèi)CLCuMV的DNA凝膠電泳條帶對比Fig.3　Comparison of DNA gel electrophoresis for CLCuMV in Phenacoccus solenopsis at different intrevals after leaving the infected plant注：C36、C48、C240、C312分別為粉蚧脫離病毒侵染植株后36、48、240、312 h。Note: C36, C48, C240, and C312 represented 36, 48, 240, and 312 h, respectively, after the mealybug leaving the infected plant.

從檢測粉蚧體內(nèi)病毒的電泳圖可觀察到，不同時間長度的病毒DNA條帶明暗程度也有很大差異，隨著時間延長DNA條帶亮度逐漸變暗(圖3)。36 h、48 h時病毒DNA條帶比較清晰明亮，而240 h、312 h時兩條條帶都非常暗淡。這說明粉蚧體內(nèi)CLCuMV不能復制增殖，而是不斷減少，360 h、480 h時已經(jīng)完全檢測不到CLCuMV DNA的存在了。

2.3不同蟲期棉花粉蚧攜帶CLCuMV的能力

檢測結(jié)果表明取食含有CLCuMV扶桑葉片48 h 后均能從各蟲態(tài)粉蚧體內(nèi)檢測到CLCuMV，其中1齡若蟲樣品陽性數(shù)量為4份，帶毒率為80%；2齡若蟲、3齡若蟲、雌成蟲CLCuMV檢出樣品數(shù)量均為5份，帶毒率為100%(表2)。

表2　棉花粉蚧不同蟲期攜帶CLCuMV的比率

2.4棉花粉蚧經(jīng)卵或者交配傳播CLCuMV的能力

結(jié)果顯示，帶毒成蟲所產(chǎn)卵、1齡若蟲中均未檢測到CLCuMV的存在。因此，可確定棉花粉蚧不能經(jīng)卵將CLCuMV傳播給子代。對于與帶毒雌蟲交配的雄蟲檢測結(jié)果表明，10頭雄蟲體內(nèi)均未檢測到CLCuMV，因此，認為棉花粉蚧不能通過交配方式將CLCuMV傳播給雄蟲。

2.5棉花粉蚧在寄主植物間傳播CLCuMV的能力

未發(fā)現(xiàn)健康扶桑葉片產(chǎn)生由CLCuMV所引起的癥狀，PCR檢測未發(fā)現(xiàn)扶桑植株里有CLCuMV。因此，經(jīng)IAP 48 h接種帶毒棉花粉蚧，不能在扶桑之間傳播CLCuMV。

3　結(jié)論與討論

本試驗應(yīng)用PCR檢測方法研究了棉花粉蚧對CLCuMV獲取、存留及傳播能力。結(jié)果表明，各蟲期粉蚧均具有攜帶CLCuMV能力。其中，3齡若蟲獲取該病毒所需時間為2-48 h，明顯長于煙粉虱對同為雙生科病毒的番茄黃化曲葉病毒的獲毒時間(僅需5-10 min)(Atzmonetal.，1998)。棉花粉蚧體內(nèi)CLCuMV殘留隨著時間推移而減少，存留時間至少為36 h，最長為312 h。

研究發(fā)現(xiàn)200頭帶毒棉花粉蚧對扶桑的傳毒率為0。由于本實驗使用的為飼毒48 h且在植株的停留時間為24 h的3齡若蟲(經(jīng)測定帶毒率為100%)，而考慮到煙粉虱獲取棉花曲葉病毒僅需15 min-4 h(Mann，2011)，帶毒粉蚧傳播葡萄卷葉病毒GLRaV-III的傳毒率在IAP 24 h達到峰值(Chiweietal.，2010)，故應(yīng)不存在獲毒失敗的可能，而在之后的檢測中并未在扶桑植株中發(fā)現(xiàn)CLCuMV。因此，認為棉花粉蚧雖然可短期攜帶CLCuMV，但是不能向健康植株傳播。此外，該蟲不能經(jīng)卵將CLCuMV傳給子代，也不能通過交配將病毒傳給雄蟲。該病毒應(yīng)不能在棉花粉蚧體內(nèi)循環(huán)增殖。綜上所述，棉花粉蚧基本上不存在傳播CLCuMV的風險，其危害方式應(yīng)不包括對棉花曲葉病的傳播。

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Acquisition, retention and transmission risk ofCottonleafcurlMultanvirusby cotton mealybugPhenacoccussolenopsisTinsley

TANG Yuan1,2, HE Mu-Yang2*, LU Yong-Yue2**

(1. Wuzhou Plant Protection Station, Wuzhou 543003, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2. Department of Entomology, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

To indentify the risk of spreading CLCuMV by cotton mealybugPhenacoccussolenopsisTinsley, it was tested that the abilities and dynamics ofP.solenopsisto acquire, conserve and transmit the virus by PCR method. The results showed that all feeding stages could acquire the virus in 2-48 h, and the virus could remain in mealybug bodies for the maximum of 312 h. However, CLCuMV in cotton mealybug nymphs was unable to infect the healthyHibiscusrosa-sinensis, and it did not transmit vertically and horizontally by oviposition and mating. This study cleared the risk ofP.solenopsistransmitting CLCuMV and provided the basis for the management of the two pests.

PhenacoccussolenopsisTinsley; CLCuMV; transmission risk

國家自然科學基金(31171855);廣東省研究生教育創(chuàng)新計劃(2013JDXM14)

唐遠，男，1988年生，廣西梧州人，碩士，研究方向為昆蟲生態(tài)學，E-mail:ty06865@qq.com

*共同第一作者，E-mail: hemuyang@stu.scau.edu.cn

**

Author for correspondence，E-mail：luyongyue@scau.edu.cn

2016-01-07；接受日期Accepted： 2016-03-23

Q965;S433

A

1674-0858(2016)04-0736-06