文謙 李芳梅 楊志波

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當歸飲子對銀屑病模型豚鼠神經(jīng)酰胺含量、AQP-3基因及蛋白表達的干預(yù)研究

文謙 李芳梅 楊志波

目的 探討當歸飲子對尋常型銀屑病模型豚鼠皮膚神經(jīng)酰胺（ceramide，Cer）含量、水通道蛋白3（aquaporin 3，AQP-3）基因及蛋白表達的干預(yù)影響。方法 建立尋常型銀屑病動物模型，分為當歸飲子組、甲氨蝶呤組、生理鹽水組、模型對照組、空白對照組，每組8只，酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）法檢測造模皮損部位Cer含量，逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）和免疫印跡試驗（Western blot）法檢測造模皮損部位AQP-3基因及蛋白表達，分析尋常型銀屑病動物模型皮損與皮膚屏障功能密切相關(guān)的基因及蛋白表達的變化。結(jié)果 豚鼠耳部皮膚銀屑病模型造模成功。模型對照組皮損中ELISA法檢測Cer含量，以及RT-PCR和Western blot法檢測AQP-3基因的蛋白表達均較低；當歸飲子組與甲氨蝶呤組和各組中Cer含量、AQP-3基因蛋白表達增強（P＜0.01），且當歸飲子組較甲氨蝶呤組增強明顯（P＜0.01）。結(jié)論 當歸飲子能增強銀屑病模型豚鼠皮膚Cer含量及AQP-3基因和蛋白表達，對改善銀屑病動物模型的皮膚屏障功能作用確切，效果優(yōu)于甲氨蝶呤組。

當歸飲子； 尋常型銀屑病； 動物模型； 皮膚屏障功能

水通道蛋白3（aquaporin 3，AQP-3）是一種細胞膜上跨膜運輸水、甘油和尿素等小分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)運蛋白，是人類皮膚中表達最多的一種水通道蛋白亞型。AQP-3不僅參與皮膚水合、皮膚屏障功能以及創(chuàng)傷愈合，維持皮膚的正常形態(tài)和功能，還與角質(zhì)形成細胞的增殖和遷移甚至早期分化有關(guān)。AQP-3與特應(yīng)性皮炎、白癜風(fēng)、皮膚腫瘤、銀屑病等多種皮膚病的發(fā)病機制相關(guān)。神經(jīng)酰胺（ceramide，Cer）是人體皮膚角質(zhì)層細胞間混合脂類物質(zhì)的主要成分，有防止水分散發(fā)和防護外界刺激的作用，具有保濕、滋潤皮膚、抗衰老、抗過敏的功能。銀屑病皮損中神經(jīng)酰胺組成的改變可能與其表皮水分丟失增加有關(guān)，特別是Cer1的減少［1］。皮膚角質(zhì)層神經(jīng)酰胺分類較多，細胞內(nèi)不同類型的神經(jīng)酰胺可發(fā)揮不同甚至相反的作用［2-3］，同時測定生物樣品中各種神經(jīng)酰胺的含量對研究神經(jīng)酰胺的生物學(xué)效應(yīng)機制具有重要意義。文獻報道中，基本分析神經(jīng)酰胺的總體水平或某一種神經(jīng)酰胺，很少涉及同時分類檢測組織或細胞內(nèi)幾種神經(jīng)酰胺的含量［4-5］。本研究僅測Cer總體水平。

研究通過觀察當歸飲子（選自《重訂嚴氏濟生方》）對尋常型銀屑病動物模型的干預(yù)，用逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）和免疫印跡試驗（Western Blot）法檢測造模皮損部位AQP-3基因及蛋白表達，用酶聯(lián)免疫吸附實驗法（ELISA）檢測造模皮損部位神經(jīng)酰胺含量，分析尋常型銀屑病動物模型皮損處與皮膚屏障功能密切相關(guān)的蛋白含量及其基因表達的變化，闡述當歸飲子對銀屑病模型豚鼠皮膚AQP-3和Cer基因及蛋白表達的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

中藥制劑：當歸20 g、白芍20 g、生地黃20 g、川芎15 g、防風(fēng)20 g、荊芥20 g、何首烏20 g、白蒺藜20 g、黃芪25 g、甘草10 g，每劑藥煎3次，混合3次藥液濃縮至300 mL。

豚鼠，雄性20只、雌性20只，共40只，體質(zhì)量210～250 g，由中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。實驗動物質(zhì)量合格證：SCXK（軍）2012-0006，合格證編號：0022614，實驗動物使用許可證：SYXK（蘇）2012-0047。

1.2 建模與藥物處理

新鮮配制的10%Na2S溶液脫去豚鼠耳背毛發(fā)，次日開始實驗。5%心得安乳劑均勻涂于豚鼠耳背皮膚，厚度1.0 mm，每天3次，連續(xù)2周，使其符合銀屑病樣病理改變［6］。40只豚鼠，空白對照組8只，余下32只造模后隨機分為模型對照組、生理鹽水組、當歸飲子組和甲氨蝶呤組4組，每組8只?？瞻讓φ战M實驗期間正常飼養(yǎng)。生理鹽水組用生理鹽水灌胃，3次/d，每次每只按體重0.01 mL/g，連續(xù)2周。當歸飲子組用稀釋的中藥灌胃，每次每只0.01 mL/g，3次/d，連續(xù)2周。甲氨蝶呤組：按成人常規(guī)用量的5倍口服給藥，給藥劑量為0.5 mg/kg，每天1次，連續(xù)2周。

1.3 標本取材及病理切片

2周后，模型對照組4只豚鼠處理耳部皮膚用10%福爾馬林固定，常規(guī)標本脫水，透明，石蠟包埋，連續(xù)性切片，厚約4 μm，行HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察皮膚有無變性壞死、潰瘍、痂皮形成，上皮層次有無增厚，表面角化不全，真皮或皮下組織內(nèi)有無充血、水腫、炎細胞浸潤等病變。處死模型對照組另外4只與其余組豚鼠，分離耳部皮膚，絞碎組織，-80℃液氮凍存。

1.4 Western Blot法檢測AQP-3蛋白的含量

手動勻漿組織，加入蛋白裂解液，離心，獲得全蛋白提取物，進行蛋白定量測定，取適量（50 μg）蛋白上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，加入一抗（用一抗稀釋液稀釋），4℃冰箱過夜孵育后洗滌加入二抗，室溫孵育2小時，TBST洗滌緩沖液洗滌后，增強化學(xué)發(fā)光法（electrochemiluminescence，ECL）顯色，使用 G：BOX chemiXR5成像。

1.5 RT-PCR法檢測AQP-3基因表達

按RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。采用軟件Primer 5設(shè)計引物，由南京金斯瑞科技有限公司合成。

GAPDH內(nèi)參上游引物：5'-AAGGTCGGAGTGAACGGATTT-3'；下游引物：5'-AGATGATGACCCTTTTGGCAC-3'，產(chǎn)物大小352 bp。

AQP-3上游引物：5'-CCCTCAGGACACTTGGACAT-3'；下游引物：5'-CGTTCTCCTGCTCGGTAGAG-3'，產(chǎn)物大小391 bp。

所有基因PCR反應(yīng)條件為：95℃5分鐘，95℃變性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸45秒，32個循環(huán)，72℃終末延伸10分鐘。

1.6 PCR產(chǎn)物鑒定

PCR擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上成電泳、免疫印跡，ECL顯色，并使用G：BOX chemiXR5成像，所有擴增產(chǎn)物的光密度峰值均以GAPDH為基準校正。使用Gel-Pro 32軟件對結(jié)果進行灰度分析。

1.7 ELISA法檢測Cer含量

在酶標包被板上空白孔、標準品及待測樣品孔中準確加入標準品原液、標準品稀釋液，后加入被稀釋到200倍的樣品，37℃溫育90分鐘，洗滌，加生物素化抗體按1∶30用抗體稀釋液稀釋，置37℃溫育60分鐘。再洗滌，標準品及待測樣品孔中加入酶標試劑，37℃溫育30分鐘。再洗滌，加入顯色液，37℃避光顯色15分鐘，終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，450 nm波長按順序測量每個孔的吸光度（OD）值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0系統(tǒng)軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模結(jié)果

豚鼠一般情況良好，沒有死亡。4塊豚鼠耳皮膚組織雙面被覆復(fù)層鱗狀上皮，上皮下可見真皮和皮膚附件，中間為軟骨，4塊組織病變相似，光學(xué)顯微鏡下示豚鼠耳部皮膚銀屑病模型造模成功。

2.2 Western blot檢測AQP-3蛋白電泳結(jié)果

模型對照組和生理鹽水組AQP-3蛋白少量表達，當歸飲子組和甲氨蝶呤組表達明顯增加，見圖1。

圖1 AQP-3蛋白電泳圖

2.3 RT-PCR檢測AQP-3電泳結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)過2%瓊脂糖凝膠電泳后，在352、391 bp處分別見GAPDH內(nèi)參、AQP-3 mRNA的表達，見圖2。AQP-3 mRNA在不同模型組表達不一，模型對照組和生理鹽水組表達最弱，而藥物（當歸飲子、甲氨蝶呤）組較前者表達明顯增加，空白對照組表達最強。

圖2 各組AQP-3 mRNA的PCR電泳圖

2.4 各組豚鼠皮膚組織細胞中AQP-3基因蛋白表達及Cer含量檢測

模型對照組與生理鹽水組AQP-3表達較空白對照組明顯下降（P＜0.01），當歸飲子組和甲氨蝶呤組AQP-3表達較模型對照組明顯上升（P＜0.01），且當歸飲子組較甲氨蝶呤組上升明顯（P＜0.01），與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。生理鹽水組與模型對照組造模組AQP-3蛋白基因表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

空白孔調(diào)零，450 nm波長按順序測量每個孔的吸光度（OD）值。造模組藥物干預(yù)前后Cer含量比正常組明顯下降（P＜0.01）；造模組藥物（甲氨蝶呤、當歸飲子）干預(yù)后Cer蛋白含量比干預(yù)前上升（P＜0.01），當歸飲子組比甲氨蝶呤組上升明顯（P＜0.01），見表1。

表1 AQP-3基因蛋白表達及與Cer含量檢測

3 討論

神經(jīng)酰胺是人體皮膚角質(zhì)層細胞間混合脂類物質(zhì)的主要成分，有防止水分散發(fā)和外界刺激作用，具有保濕、滋潤皮膚、抗衰老、抗過敏的功能。在皮膚中神經(jīng)酰胺的含量隨著機體的老化不斷減少，神經(jīng)酰胺的減少可引起皮膚功能的異常，瘙癢類皮膚病患者的干燥性皮損中神經(jīng)酰胺的含量明顯低于正常皮膚的含量［7］。在角質(zhì)層中，神經(jīng)酰胺具有保水作用，從而進一步提高了皮膚屏障功能。皮膚疾病如銀屑病、異位性皮炎等的發(fā)生與角質(zhì)層中神經(jīng)酰胺水平的改變，都與經(jīng)皮水分丟失密切相關(guān)［8］。神經(jīng)酰胺參與細胞的增殖、分化、生長抑制、衰老、凋亡及細胞分泌等多種生理病理過程，其含量的減少可使角化細胞間黏著力下降，細胞排列紊亂、錯位，水分丟失，導(dǎo)致皮膚干燥、脫屑，呈鱗片狀［9］。AQP-3的主要作用是跨膜轉(zhuǎn)運水分、甘油、尿素等物質(zhì)以調(diào)節(jié)皮膚的水平衡，起保濕作用。AQP-3不僅參與皮膚水合作用、構(gòu)成和調(diào)節(jié)皮膚屏障功能，保持正常皮膚的功能和形態(tài)，AQP-3還參與角質(zhì)形成細胞的分化，所以能夠幫助皮膚外傷的愈合和恢復(fù)，在維持皮膚形態(tài)、皮膚屏障功能、保濕、創(chuàng)傷愈合中發(fā)揮重要作用，并與特應(yīng)性皮炎、白癜風(fēng)、瘤、銀屑病等多種皮膚病的發(fā)病密切相關(guān)［10］。學(xué)者發(fā)現(xiàn)AQP-3在銀屑病皮損中表達下降，且分布的部位發(fā)生異常，散在地分布于細胞質(zhì)中［11］。

本實驗結(jié)果顯示，模型豚鼠耳部皮膚神經(jīng)酰胺含量表達降低（P＜0.01），模型豚鼠皮膚組織細胞中AQP-3基因及蛋白表達降低（P＜0.01），表明Cer與AQP-3參與了銀屑病的病理演變，直接或間接影響了皮膚的屏障功能。藥物干預(yù)后，當歸飲子組和甲氨蝶呤組Cer蛋白含量表達增強，表明藥物干預(yù)對銀屑病模型病理變化有改善作用，且當歸飲子組優(yōu)于甲氨蝶呤組（P＜0.01）。生理鹽水組與模型對照組AQP-3、Cer蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示生理鹽水對模型病理變化沒有影響。

本研究中中藥方劑當歸飲子具有養(yǎng)血潤燥，祛風(fēng)止癢，益氣固表，涼血，活血化瘀等功效。尋常型銀屑病動物模型皮損的AQP-3基因及蛋白表達明顯下降，Cer含量也明顯下降；當歸飲子組和甲氨蝶呤組干預(yù)后AQP-3、Cer上升，證明當歸飲子、甲氨蝶呤改善銀屑病動物模型的皮膚屏障功能作用確定，且當歸飲子組優(yōu)于甲氨蝶呤組。由于銀屑病的發(fā)病機制不明，有復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)參與銀屑病發(fā)病過程，推測當歸飲子對尋常型銀屑病模型皮膚屏障功能的調(diào)節(jié)作用可能是通過增加皮脂含量，調(diào)節(jié)皮膚屏障功能相關(guān)的保濕因子基因和蛋白的表達而使皮膚的屏障功能恢復(fù)正常。

［1］ Jennemann R，Sandhoff R，Langbein L，et al.Integrity and bartier function of the epidermis critically depend on glueasylceramide synthesis［J］.J Biol Chem，2007，282（5）：3083-3094.

［2］ Senkal CE，Ponnusamy S，Bielawski J，et al.Antiapoptotic roles of ceramide-synthase-6-generatedC16-ceramideviaselective regulationoftheATF6/CHOParmofER-stress-response pathways［J］.FASEB J，2010，24（1）：296-308.

［3］ Sassa T，Suto S，Okayasu Y，et al.A shift in sphingolipid composition from C24 to C16 increases susceptibility to apoptosis in HeLa cells［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1821（7）：1031-1037.

［4］ Kasumov T，Huang H，Chung YM，et al.Quantification of ceramide species in biological samples by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry［J］.Anal Biochem，2010，401（1）：154-161.

［5］ Haynes TAS，Duerksen-Hughes PJ，F(xiàn)ilippova M，et al.C18 ceramide analysis in mammalian cells employing reversed-phase high-performanceliquidchromatographytandemmass spectrometry［J］.Anal Biochem，2008，378（1）：80-86.

［6］ 孫建方，高天文.皮膚組織病理學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：20-35.

［7］ Darlenski R，Sassning S，Tsankov N，et al.Non-invasive in vivo methods for investigation of the skin barrier physical properties ［J］.Eur Journalof pharmaceutics and biopharmaceutics，2009，72：295-303.

［8］ Ishikawa J，Shimotoyodome Y，Chen S，et al.Eucalyptus increases ceramide levels in keratinocytes and improves stratum corneum function［J］.Int J Cosmet Sci，2012，34（1）：17-22.

［9］ Menon GK，Kligman AM.Barrier Fuctions of Human Skin：AHolistic View［J］.Skin Pharmacol Physiol，2009，22（4）：178-189.

［10］ 張靜霞.AQP3在皮膚病發(fā)病機制中的作用研究進展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2013，19（17）：3101-3103.

［11］ Voss KE，Bollag RJ，F(xiàn)ussell N，et al.Abnormal aquaporin-3 protein expression in hyperproliferative skin disorders［J］.Arch Dermatol Res，2011，303（8）：591-600.

（本文編輯：董歷華）

The intervention study of Danggui Yinzi decoction on the expression of gene and protein of AQP-3 and the content of ceramide in the posriasis vulgaris model of guinea pig

WEN Qian，LI Fang-mei， YANG Zhi-bo.Department of Dermatological，Affiliated Hospital of Chinese Medicine，Xinjiang Medical University，Urumqi 830000，China

YANG Zhi-bo，E-mail：dr.yang888@126.com

Objective To investigate the effect of Danggui Yinzi on the expression of AQP-3 gene and Cer protein of psoriasis model.Methods To establish an animal model of psoriasis vulgaris.The animals were divided into Danggui Yinzi group，methotrexate group，saline group，model control group and blank control group.Aquaporin 3（AQP-3）of skin lesions part was detected with RT-PCR and Western blot methods and ELISA methods was used to detect the ceramide content of skin lesions part.Compared the results of the five groups，and the relationship of the expression changes of gene and protein in skin lesions and skin barrier function was analysed.Results The animal models of psoriasis vulgaris was successful In model control group，the content of ceramide and the expression of gene and protein of AQP-3 were all decreased significantly（P＜0.01）.The expression index was increased in Danggui Yinzi group and methotrexate group and Danggui Yinzi group was increased obviously（P＜0.01）.Conclusion

Danggui Yinzi can enhance the expression of gene and protein of AQP-3 and the protein content of ceramide in skin lesions of psoriasis vulgaris model.It has a definite effect for skin barrier function of psoriasis vulgaris in animal model.The results indicate that the therapeutic effect is more effective than methotrexate

Danggui Yinzi； Posriasis vulgaris； Animal model； Skin barrier function

R285.5

A doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.08.003

湖南省科技計劃（2011FJ3026）

830000 烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院皮膚科（文謙）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院（李芳梅）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中醫(yī)外科皮膚科（楊志波）

文謙（1968-），碩士，主治醫(yī)師。研究方向：中醫(yī)藥防治皮膚病和性病的理論與臨床研究。E-mail：wenq828@163.com

楊志波（1956-），碩士，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治皮膚病研究。E-mail：dr.yang888@126.commedicine.

（2015-12-27）