潘舒月，朱　勇#，劉　怡，青玉鳳，張夢(mèng)云，蒲夢(mèng)君，周京國(guó)△

(1.成都市第五人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科　611130；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，四川南充 637000)

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高遷移率族蛋白B1及其糖基化終產(chǎn)物受體在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中的變化及其臨床意義*

潘舒月1，朱勇1#，劉怡1，青玉鳳2，張夢(mèng)云2，蒲夢(mèng)君2，周京國(guó)2△

(1.成都市第五人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科611130；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，四川南充 637000)

目的探討高遷移率族蛋白B1(HMGB1)及其糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)發(fā)病中可能的作用。方法采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)52例SLE女性患者(SLE組)及40例體檢健康女性(HC組)血漿HMGB1水平；同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)外周血單核細(xì)胞(PBMCs)HMGB1及RAGE mRNA表達(dá)水平；并分析SLE患者血漿HMGB1及PBMCs HMGB1、RAGE mRNA水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果SLE組患者血漿HMGB1及PBMCs HMGB1 mRNA水平高于HC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而PBMCs RAGE mRNA水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Spearman相關(guān)性分析顯示，SLE患者血漿HMGB1水平與抗核抗體滴度、SLE活動(dòng)性指數(shù)(SLEDAI)評(píng)分均呈正相關(guān)(P<0.05)，與其他臨床和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)無明顯相關(guān)性(P>0.05)；HMGB1 mRNA表達(dá)水平與RAGE mRNA表達(dá)水平、SLEDAI評(píng)分均呈正相關(guān)(P<0.01，P<0.05)，與其他臨床和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)無明顯相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論血漿HMGB1及PBMCs HMGB1 mRNA在SLE患者的異常表達(dá)提示其可能在SLE的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用，可能參與了SLE的免疫炎癥調(diào)節(jié)。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡；高遷移率族蛋白B1；糖基化終產(chǎn)物受體；炎癥

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種可累及全身多系統(tǒng)多器官的自身免疫性結(jié)締組織病，好發(fā)于中青年女性，以免疫性炎癥為突出表現(xiàn)，常與遺傳、性激素、免疫功能紊亂及外界環(huán)境等因素有關(guān)，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[1-2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)是一種重要的炎性介質(zhì)，在一定條件下可釋放至胞外參與機(jī)體炎性反應(yīng)[3]。研究發(fā)現(xiàn)其在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、腫瘤等疾病中發(fā)揮著重要作用[4-6]。HMGB1在SLE中的作用機(jī)制研究，目前國(guó)內(nèi)外尚無統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，HMGB1是如何參與SLE的炎癥發(fā)生過程，HMGB1介導(dǎo)的信號(hào)通路是否在其中發(fā)揮了重要作用，尚需要更進(jìn)一步的研究。因此，本課題組對(duì)HMGB1及其重要受體糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)在SLE患者中的變化進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

表1　　兩組一般資料比較±s)

-：無數(shù)據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科2012年1～12月門診或住院的活動(dòng)期SLE女性患者52例納入SLE組，年齡18～69歲，平均(37±12)歲；病程1個(gè)月至10年，平均(5±3)年。均采用美國(guó)SLE活動(dòng)性指數(shù)(SLEDAI)[7]進(jìn)行評(píng)分，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0～4分，基本無活動(dòng)；5～9分，輕度活動(dòng)；10～14分，中度活動(dòng)；≥15分，重度活動(dòng)；輕、中、重度活動(dòng)均納入。同時(shí)收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院40例女性體檢健康者作為健康對(duì)照(healthy control，HC)組，年齡22～62歲，平均(38±15)歲，均無實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)異常，均排除其他自身免疫性疾病、感染性疾病及腫瘤疾病。研究程序符合川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制訂的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并得到該倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，且所有受試者均知情同意。

1.2方法

1.2.1常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)測(cè)定實(shí)驗(yàn)室常規(guī)指標(biāo)測(cè)定均在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科完成，血細(xì)胞分析采用美國(guó)Beckman公司生產(chǎn)的LH750血細(xì)胞分析儀，血生化儀分析采用美國(guó)Beckman公司生產(chǎn)的DxC800全自動(dòng)生化儀；包括血細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞沉降率(ESR)、C反應(yīng)蛋白、肝功能、腎功能、抗核抗體譜等。

1.2.2血漿HMGB1水平測(cè)定采集所有研究對(duì)象清晨空腹(8 h以上)外周靜脈血5 mL(肝素鈉抗凝)，3 000 r/min離心10 min分離血漿，-20 ℃保存標(biāo)本。人HMGB1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自USCN生命科學(xué)公司。操作步驟按照說明書：在已包被HMGB1抗體的酶標(biāo)板上，每孔加入已稀釋樣品血漿100 μL或100 μL標(biāo)準(zhǔn)品，37 ℃孵育2 h，棄去液體，甩干后加入檢測(cè)溶液A 100 μL，37 ℃孵育1 h，洗滌液洗板3次，加檢測(cè)溶液B 100 μL，37 ℃孵育30 min，洗滌液洗板5次，加3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物90 μL，37 ℃避光孵育15～25 min，加終止液50 μL，立即在酶標(biāo)儀上以450 nm為測(cè)量波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度(A)值。每個(gè)標(biāo)本均做復(fù)孔，取其平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品A值及濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測(cè)血漿的HMGB1水平。

1.2.3外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)總RNA的提取及cDNA的合成人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊锕?分離52例SLE患者及年齡與之匹配的40例HC的PBMCs，采用Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)一步提取PBMCs總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定A260/A280(1.8～2.0者采用)。取6 μL總RNA，3 μL隨機(jī)引物，3 μL反錄酶ReverTra Ace，5×RT-增強(qiáng)添加劑(RT-Enhancer)1.5 μL，5×RT緩沖液12 μL，三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)混合物6 μL，Super-R1 1.5 μL，去RNA酶水(RNase-free H2O)24 μL至總反應(yīng)體積60 μL，于42 ℃反應(yīng)60 min，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4HMGB1、RAGE及內(nèi)對(duì)照β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)mRNA表達(dá)檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time quantitative PCR，RT-qPCR)進(jìn)行檢測(cè)，用于擴(kuò)增的引物均由上海生工生物工程公司合成，HMGB1序列：上游引物5′-TTA CAG AGC GGA GAG AGT GAG G-3′，下游引物5′-TGA CAT TTT GCC TCT CGG CT -3′；RAGE序列：上游引物5′-GGC TGG TGT TCC CAA TAA-3′；下游引物5′-CAC AGA TAC TCC CTT CTC ATT-3′；β-actin：上游引物5′-GAG CTA CGA GCT GCC TGA CG-3′；下游引物5′-GTA GTT TCG TGG ATG CCA CAG-3′。HMGB1 PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為193 bp，RAGE PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為118 bp，β-actin PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為120 bp。試劑盒為RT-qPCR試劑盒(成都博瑞克公司)，熒光染料試劑盒(Power SYBR Green PCR Master Mix，美國(guó)ABI公司)，嚴(yán)格遵循說明書，采用20 μL反應(yīng)體系：包括10 μL Power SYBR Green PCR Master Mix，各0.5 μL 10 pmol/L上下游引物，2 μL cDNA，7 μL雙蒸水。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每份標(biāo)本均作復(fù)孔，復(fù)孔間的Ct值差異控制在0.5以內(nèi)。所有擴(kuò)增均在7900 Real-Time PCR儀(美國(guó)ABI公司)上進(jìn)行。以目的基因的Ct值減去內(nèi)參的Ct值為△Ct，2-△Ct值表示目的基因mRNA表達(dá)水平的高低。

2　結(jié)　　果

2.1兩組一般資料比較兩組紅細(xì)胞(RBC)計(jì)數(shù)、尿酸(UA)、三酰甘油(TG)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而年齡、白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)及肌酐(Crea)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2兩組血漿HMGB1及PBMCs HMGB1、RAGE mRNA水平比較SLE組患者血漿HMGB1水平與PBMCs HMGB1 mRNA表達(dá)水平均高于HC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)； 而兩組PBMCs RAGE mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。SLE組52例患者中，36例有腎臟損傷，16例無腎臟損傷，有、無腎臟損傷的SLE患者血漿HMGB1及PBMCs HMGB1、RAGE mRNA表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

2.3SLE患者血漿HMGB1及PBMCs HMGB1、RAGE mRNA水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性SLE患者血漿HMGB1濃度與抗核抗體滴度、SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān)(P均<0.05)，與其他臨床和實(shí)驗(yàn)指標(biāo)之間無明顯相關(guān)性(均P>0.05)，見表4。

表2　　兩組血漿HMGB1及PBMCs HMGB1、RAGE mRNA水平比較

表3　　有、無腎臟損傷的SLE患者血漿HMGB1及PBMCsHMGB1、RAGE mRNA水平比較

表4　　SLE患者血漿HMGB1、PBMCs HMGB1及RAGEmRNA水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性(n=52)

LY：淋巴細(xì)胞，TC：總膽固醇；Alb：清蛋白；GLOB：球蛋白；GLU：葡萄糖；ANA：抗核抗體；C3：補(bǔ)體3；C4：補(bǔ)體4；-：無數(shù)據(jù)。

3　討　　論

SLE是多種自身抗體介導(dǎo)的自身免疫炎性疾病，多種炎性因子及其信號(hào)通路參與了SLE疾病的發(fā)生、發(fā)展過程。HMGB1還是一種核內(nèi)非組蛋白，參與DNA的組成，其在進(jìn)化過程中高度保守[8]。近年來發(fā)現(xiàn)，HMGB1還是一種新型的強(qiáng)大致炎細(xì)胞因子，可通過體內(nèi)壞死細(xì)胞的被動(dòng)分泌或者受一定刺激的單核細(xì)胞等細(xì)胞的主動(dòng)分泌使其在細(xì)胞外參與機(jī)體的免疫炎性反應(yīng)[9]；HMGB1可以促進(jìn)多種炎性因子的釋放，包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8等的釋放[10]。HMGB1與RAGE、Toll樣受體(TRL)2、TRL4、TRL9等受體結(jié)合后，形成炎癥信號(hào)通路的上游部分，活化核因子-κB(NF-κB)等下游信號(hào)分子，參與機(jī)體的免疫炎性反應(yīng)過程[11-12]；其中RAGE是HMGB1眾多受體中較為重要的受體，與HMGB1有很高的親和力，二者結(jié)合后形成炎癥信號(hào)通路參與機(jī)體炎性反應(yīng)，在多種疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。

本課題組研究發(fā)現(xiàn)，SLE組患者血漿HMGB1水平明顯高于HC組(P<0.01),且相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)血漿HMGB1與抗核抗體呈正相關(guān)，提示HMGB1可能參與了SLE的免疫炎性反應(yīng)過程，其有望成為判斷SLE炎性反應(yīng)的一項(xiàng)新指標(biāo)。通過RT-qPCR本課題發(fā)現(xiàn)，SLE組患者PBMCs HMGB1 mRNA表達(dá)水平明顯高于HC組(P<0.01)。而SLE組患者PBMCs RAGE mRNA表達(dá)水平高于HC組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，造成該結(jié)果原因可能是：(1)樣本量不足，加大樣本量有可能得到不同的結(jié)果；(2)HMGB1參與SLE的炎性反應(yīng)過程可能不是重點(diǎn)通過HMGB1-RAGE結(jié)合后形成的信號(hào)通路發(fā)揮作用，而是借助于其他炎癥信號(hào)通路參與SLE的發(fā)病機(jī)制。Lutterloh等[12]研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞NF-κB的活化可通過TLR2和TLR4受體與HMGB1結(jié)合后形成的炎癥信號(hào)通路；Tian等[10]與Urbonaviciute等[13]發(fā)現(xiàn)，在SLE發(fā)病機(jī)制中，HMGB1-DNA免疫復(fù)合物起著重要作用，而該復(fù)合物的產(chǎn)生主要依賴TRL如TRL2、TRL4、TRL9等。此外，文獻(xiàn)[14-17]研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1通過與TRL、RAGE受體結(jié)合后參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎炎的發(fā)病。本次研究發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎炎患者血漿HMGB1及PBMCs HMGB1、RAGE mRNA水平與無腎臟損傷患者比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能是由于樣本量不足導(dǎo)致，加大樣本量可能會(huì)得到不同結(jié)果，但筆者更傾向于在系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎炎的發(fā)病過程中，HMGB1參與其發(fā)病過程更多是通過與TRL等HMGB1相關(guān)受體結(jié)合后，參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎炎的免疫炎性反應(yīng)過程。通過以上研究筆者推斷在SLE的發(fā)病過程中，HMGB1可能更多的是與TRL結(jié)合形成炎癥信號(hào)通路，活化下游信號(hào)通路分子，參與機(jī)體的免疫炎性反應(yīng)過程，RAGE在HMGB1參與SLE發(fā)病過程中可能起次要作用或者不起作用，該推論有待做進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，活動(dòng)期SLE患者血漿HMGB1及PBMCs HMGB1 mRNA的異常高表達(dá)提示，HMGB1可能參與了SLE的炎性免疫反應(yīng)過程。然而HMGB1如何介導(dǎo)SLE的發(fā)病，是單獨(dú)參與或是HMGB1與其受體結(jié)合后形成免疫炎癥信號(hào)通路參與SLE的發(fā)生與發(fā)展，還有待后期從蛋白質(zhì)水平及HMGB1其他相關(guān)受體方面做進(jìn)一步的深入研究，以明確SLE的發(fā)病機(jī)制，為SLE的治療提供新方向。

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Change and clinical significance of high mobility group protein B1 and its advanced glycation end product receptor in patients with systemic lupus erythematosus*

PanShuyue1，ZhuYong1#，LiuYi1，QingYufeng2，ZhangMengyun2，PuMengjun2，ZhouJingguo2△

(1.DepartmentofRheumatology,ChengduMunicipalFifthPeople′sHospital,Chengdu,Sichuan611130,China；2.DepartmentofRheumatology,AffiliatedHospitaltoNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China)

ObjectiveTo investigate the possible role of high mobility group box 1 protein (HMGB1) and its advanced glycation end products receptor (RAGE) in the pathogenesis of systemic lupus erythematosus (SLE).MethodsThe enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to determine the level of plasma HMGB1 in 52 cases of SLE (SLE group) and 40 healthy females undergoing physical examination (HC group),at the same time real time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was employed to detect the expression of HMGB1 and RAGE mRNA in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs).The correlation between plasma HMGB1,PBMCs HMGB1 and RAGE mRNA levels with clinical indicators was analyzed.ResultsThe levels of plasma HMGB1,PBMCs HMGB1 mRNA in the SLE group were significantly higher than those in the HC group,the differences were statistically significant(P<0.05),while the level of PBMCs RAGE mRNA had no statistical difference(P>0.05);the Spearman correlation analysis showed that the level of plasma HMGB1 was positively correlated with antinuclear antibodies titers and SLEDAI score in the SLE patients(P<0.01),while had no obvious correlation with the other clinical and laboratory indicators(P>0.05); the HMGB1 mRNA expression level was positively correlated with the RAGE mRNA expression level and SLEDAI scores(P<0.01,P<0.05),and had no obvious correlation with other clinical and laboratory indicators(P>0.05).ConclusionThe abnormal expression of plasma HMGB1 and PBMCs HMGB1 mRNA in SLE patients prompts that which might be involved in the occurrence and development of SLE,might participate in the immune and inflammatory regulation of SLE.

systemic lupus erythematosus；high mobility group box 1 protein；receptor for advanced glycation end products；inflammation

四川省省屬高?？蒲袆?chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目(14TD0021)。#共同第一作者。作者簡(jiǎn)介：潘舒月(1988-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事風(fēng)濕免疫學(xué)研究；朱勇(1968-)，副主任醫(yī)師，本科，主要從事風(fēng)濕免疫學(xué)研究?！?/p>

，E-mail:jgzhou@nsmc.edu.cn。。

R392.32

A

1671-8348(2016)21-2922-04

2016-01-11

2016-03-29)

論著·臨床研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.21.013