王　雷，杜媛鯤，王　娜

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸二科，石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)期刊社，石家莊 050017；3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院河北省腫瘤研究所分子生物室，石家莊 050011)

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Gli抑制劑GANT61對(duì)肺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用的研究

王雷1，杜媛鯤2，王娜3

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸二科，石家莊 050011；2.河北醫(yī)科大學(xué)期刊社，石家莊 050017；3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院河北省腫瘤研究所分子生物室，石家莊 050011)

目的研究GANT61對(duì)人肺癌細(xì)胞H1703和A549的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響，并初步探討其作用機(jī)制。方法以二甲基亞砜(DMSO)作為對(duì)照(DMSO組)，用GANT61處理H1703和A549細(xì)胞24 h后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)Gli-1、Gli-2、E-cadherin和Vimentin基因變化；蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)觀察GANT61作用于H1703和A549細(xì)胞后對(duì)E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)的影響，劃痕愈合實(shí)驗(yàn)觀察GANT61作用于H1703和A549細(xì)胞后對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果與DMSO組比較，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示GANT61可下調(diào)H1703和A549細(xì)胞Gli-1、Gli-2及Vimentin mRNA的表達(dá)，升高E-cadherin mRNA的表達(dá)(P<0.01)；Western blotting顯示，GANT61可以下調(diào)H1703和A549細(xì)胞Vimentin蛋白表達(dá)，升高E-cadherin蛋白表達(dá)(P<0.01)；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)顯示，GANT61處理組H1703和A549細(xì)胞的侵襲能力明顯下降(P<0.01)。結(jié)論肺癌的EMT與Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Gli-1和Gli-2的異常激活有關(guān)，GANT61通過(guò)下調(diào)Gli-1和Gli-2的表達(dá)影響肺癌細(xì)胞的EMT能力，Gli可能成為抑制肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的新的分子靶點(diǎn)。

肺癌；Hedgehog信號(hào)通路；GANT61；Gli蛋白；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

每年全球肺癌發(fā)病率和病死率高居各種惡性腫瘤之首，肺癌是我國(guó)增長(zhǎng)速度最快的惡性腫瘤之一。肺癌病理學(xué)分型主要為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌，其中鱗癌和腺癌為最常見(jiàn)的非小細(xì)胞肺癌類型，患者確診時(shí)多為中晚期，傳統(tǒng)放療、化療效果欠佳。近年來(lái)如酪胺酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKI)等靶向治療已經(jīng)使部分腺癌患者受益，但多數(shù)非小細(xì)胞肺癌患者仍然沒(méi)有找到更合適的治療靶點(diǎn)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，異?；罨疕edgehog(Hh)信號(hào)通路在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[1-5]。經(jīng)典的Hh信號(hào)傳導(dǎo)通路主要包括Hh配體、Patched受體、Smoothened蛋白、核轉(zhuǎn)錄因子Gli及下游目的基因[6]。GANT61是近年研制的特異性針對(duì)Gli靶點(diǎn)的Hh通路抑制劑，具有較好的抗腫瘤活性。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細(xì)胞通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程，這種過(guò)程使上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力，并且與腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。目前，關(guān)于Hh通路與肺癌EMT關(guān)系的研究較少，本研究通過(guò)探討GANT61特異性阻斷人肺癌細(xì)胞系H1703和A549中Gli-1和Gli-2的表達(dá)，觀察其對(duì)肺癌細(xì)胞EMT的影響，初步探討Hh通路與肺癌EMT的關(guān)系，以及GANT61的作用機(jī)制，為肺癌靶向治療提供新思路。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞來(lái)源人肺鱗癌細(xì)胞系H1703和腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院河北省腫瘤研究所分子生物室提供。

1.2儀器與試劑GANT61(美國(guó)Selleckchem公司)，Gli-1引物和探針(Hs00171790，美國(guó)Life technologies公司)，Gli-2引物和探針(Hs01119974_m1，美國(guó)Life technologies公司)，E- cadherin 引物和探針(Hs01023894_m1，美國(guó)Life technologies公司)，Vimentin引物和探針(Hs00257977_m1，美國(guó)Life technologies公司)，3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物和探針(Hs02758991_g1，美國(guó)Life technologies公司)，上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E-cadherin)鼠抗人單克隆抗體(ab1416，美國(guó)Abcam公司)，波形蛋白(Vimentin)兔抗人單克隆抗體(ab92547，美國(guó)Abcam公司)，GAPDH鼠抗人單克隆抗體(sc32233，美國(guó)Santa Cruz公司)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析試劑盒(美國(guó)Thermo Scientific公司)，M-PER培養(yǎng)細(xì)胞總蛋白提取試劑(美國(guó)Thermo Scientific公司)，蛋白酶抑制劑(德國(guó)roche公司)，cDNA合成試劑盒(美國(guó)Bio-Rad公司)，總RNA提取試劑盒(德國(guó) Qiagen公司)，Taqman 基因表達(dá)預(yù)混液(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，Mini-PROTEAN TGX 預(yù)制膠(美國(guó)Bio-Rad公司)，Tris/甘氨酸/電泳緩沖液(美國(guó)Bio-Rad公司)，Tris/甘氨酸緩沖液(美國(guó)Bio-Rad公司)，SuperSignal West Femto最高靈敏度底物(美國(guó)Thermo-Pierce公司)。NanoDrop 8000全光譜紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific公司)，Veriti?96-Well Thermal Cycler(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)，ABI 7900HT高通量熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)將人肺癌細(xì)胞系H1703和A549細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液、10%胎牛血清、青鏈霉素各100 U/mL的培養(yǎng)基中，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種到6孔和12孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR)法于12孔板內(nèi)呈70%～80%融合生長(zhǎng)的H1703和A549細(xì)胞中加入濃度為10 μmol/L的GANT61，并同時(shí)更換無(wú)血清培養(yǎng)基，繼續(xù)處理24 h，對(duì)照組為二甲基亞砜(DMSO)組。(1)24 h后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA，每孔加總RNA提取試劑盒中提供的裂解緩沖液RLT 350 μL和70%無(wú)水乙醇350 μL；接著將裂解液上樣到帶有RNeasy硅膠膜的柱子中，12 000 r/min離心15 s后倒掉廢液，加入去蛋白液RW1 700 μL 12 000 r/min離心15 s倒掉廢液，再加入緩沖液RPE 500 μL有效洗滌去除其他各種污染物。最后將濃縮的純RNA洗脫到無(wú)RNA酶的水中。(2)將經(jīng)RNeasy技術(shù)純化得到的RNA在NanoDrop 8000全光譜紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)儀器中檢測(cè)RNA濃度，采用美國(guó)Bio-Rad公司的反轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒(iScript cDNA Synthesis Kit)和Veriti?96-Well Thermal Cycler儀器進(jìn)行cDNA的反轉(zhuǎn)錄，方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，反轉(zhuǎn)錄條件：25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min和85 ℃ 5 min。(3)將cDNA稀釋10倍后加 cDNA、Taqman基因表達(dá)預(yù)混液，以及Gli-1、Gli-2、E-cadherin、Vimentin和GAPDH引物和探針到384孔板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系每孔10 μL(cDNA 4.5 μL，引物和探針0.5 μL，Taqman基因表達(dá)預(yù)混液5 μL)，PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)。讀取Ct值后采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.3蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)設(shè)對(duì)照組為DMSO，于6孔板內(nèi)呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1703和A549細(xì)胞加濃度為10 μmol/L的GANT61，并同時(shí)更換無(wú)血清培養(yǎng)基處理24 h，用PBS洗滌細(xì)胞后加細(xì)胞蛋白提取液和蛋白酶抑制劑，收集提取液后用BCA法測(cè)定蛋白濃度。于Mini-PROTEAN TGX預(yù)制膠中行蛋白上樣，每泳道上樣10 μg蛋白，在電泳槽中經(jīng)Tris/甘氨酸/電泳緩沖液十二烷基硫酸鈉(SDS)進(jìn)行電泳后在Tris-甘氨酸緩沖液中將蛋白電轉(zhuǎn)移印跡到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，再用5%脫脂奶粉/含吐溫20的Tris緩沖液(TBST)封閉PVDF膜1 h，E-cadherin工作濃度為1∶5 000、Vimentin工作濃度為1∶10 000，GAPDH工作液濃度為1∶10 000，4 ℃過(guò)夜，二抗工作濃度為1∶20 000孵育1 h后用TBST洗膜，再用SuperSignal West Femto最高靈敏度底物試劑發(fā)光后于暗室曝光顯影。

1.3.4劃痕愈合實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，置37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜。第2天培養(yǎng)至細(xì)胞呈70%～80%融合時(shí)加入濃度為10 μmol/L的GANT61處理 24 h，對(duì)照組為DMSO組，分別在GANT61處理組和對(duì)照組的單細(xì)胞層上劃痕，繼續(xù)培養(yǎng)以使劃痕愈合。于劃痕后24 h每組取4個(gè)視野拍照，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的劃痕愈合能力，用愈合率代表愈合能力。閉合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)GANT61作用24 h對(duì)H1703和A549細(xì)胞Gli-1、Gli-2、E-cadherin及Vimentin基因的影響，結(jié)果表明：H1703細(xì)胞株中GANT61處理組Gli-1、Gli-2和Vimentin mRNA的表達(dá)水平低于對(duì)照組，E-cadherin mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.003、0.001、0.004、0.001)；經(jīng)GANT61處理的A549細(xì)胞Gli-1、Gli-2和Vimentin mRNA的表達(dá)水平低于對(duì)照組，E-cadherin mRNA的表達(dá)水平較對(duì)照組上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.009、0.002、0.001、0.000)，見(jiàn)圖1。

A、C：H1703細(xì)胞；B、D：A549細(xì)胞。*：P<0.01，與DMSO組比較。

圖1實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2Western blotting檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用GANT61處理H1703后，E-cadherin蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，Vimentin表達(dá)低于對(duì)照組，而內(nèi)參GAPDH蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化；A549細(xì)胞處理組E-cadherin蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，而Vimentin蛋白表達(dá)低于對(duì)照組，內(nèi)參GAPDH蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2、3。

*：P<0.01，與DMSO組比較。

圖2Western bloting檢測(cè)結(jié)果

2.3劃痕愈合試驗(yàn)GANT61處理18 h后，H1703的侵襲能力明顯受到抑制，閉合率為DMSO組的72%,與DMSO組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。A549細(xì)胞GANT61處理組閉合率僅為DMSO組的45.4%，與DMSO組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。見(jiàn)圖4。

*：P<0.01，與DMSO組比較。

圖3Western blottting檢測(cè)結(jié)果

*：P<0.01，與DMSO組比較。

圖4劃痕愈合實(shí)驗(yàn)

3　討　　論

經(jīng)典的Hh通路包括兩部分：(1)活化的Hh信號(hào)從質(zhì)膜到胞內(nèi)的過(guò)程,該過(guò)程涉及Smo的調(diào)控；(2)信號(hào)從胞內(nèi)到核內(nèi)的過(guò)程，該過(guò)程涉及轉(zhuǎn)錄因子家族Gli的調(diào)控。Gli蛋白家族包括3種形式：Gli-1、Gli-2和Gli-3。Gli-3被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄抑制因子。Gli-1上調(diào)是Hh通路激活的重要標(biāo)志，Gli-2是Hh信號(hào)調(diào)節(jié)的主要轉(zhuǎn)錄激活子，Gli-1和Gli-2在活化的Hh通路中起到承上啟下的核心作用，可以促進(jìn)靶基因的異常表達(dá)，從而造成細(xì)胞過(guò)度增殖并最終癌變和轉(zhuǎn)移。Li等[8]在對(duì)間皮瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，Gli靶點(diǎn)的抑制劑比針對(duì)Smo靶點(diǎn)的小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)，以及小分子藥物維莫德吉(vismodegib)、環(huán)巴胺(cyclopamine)等具有更好的抗腫瘤效應(yīng)，以Gli-1和Gli-2為靶點(diǎn)對(duì)Hh信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控可以起到精確高效的作用。因此，本研究選擇Gli特異性抑制劑GANT61進(jìn)行抗腫瘤研究，結(jié)果顯示GANT61可以明顯下調(diào)H1703和A549細(xì)胞Gli-1、Gli-2基因的表達(dá)，表明肺癌細(xì)胞中存在Gli的異常激活，GANT61可以明顯抑制Gli的表達(dá)。

EMT是近年來(lái)抗腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，EMT可以參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，其中E-cadherin是EMT特異性標(biāo)記物之一，其表達(dá)水平降低可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞間黏附能力減低，遷移能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移[9]。Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞的重要標(biāo)記物之一，可使細(xì)胞黏著斑的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而影響腫瘤細(xì)胞的黏附與遷移能力，抑制Vimentin的表達(dá)可以減弱腫瘤細(xì)胞黏附、遷移能力[10]。本研究顯示，應(yīng)用GANT61處理肺癌細(xì)胞24 h后可以下調(diào)Vimentin mRNA和蛋白表達(dá)，上調(diào)E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)。分析其原因可能是Gli-1和Gli-2作為Hh信號(hào)調(diào)節(jié)的主要轉(zhuǎn)錄激活子，可將異常激活的Hh/Gli信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)對(duì)多種靶基因起轉(zhuǎn)錄激活作用。因?yàn)镋MT的發(fā)生涉及多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與其中，與誘導(dǎo)因子、轉(zhuǎn)錄因子及微環(huán)境等因素有關(guān)。有研究顯示，轉(zhuǎn)錄因子Gli可以通過(guò)調(diào)控EMT促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[11-12]。本研究表明，GANT61可以通過(guò)靶向性抑制Gli-1和Gli-2的表達(dá)來(lái)上調(diào)E-cadherin，下調(diào)Vimentin，從而最終調(diào)控肺癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程。本研究的劃痕實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了GANT61處理組腫瘤細(xì)胞的侵襲能力可以明顯下降。

綜上所述，由于過(guò)度活化的Hh信號(hào)通路在肺癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用，以及Gli在Hh信號(hào)傳導(dǎo)通路中的核心作用，針對(duì)Gli靶點(diǎn)的治療可能成為肺癌治療的新策略之一。

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Study on role of GANT-61 as Gli inhibitor on epithelial-mesenchymal transition of lung cancer

WangLei1，DuYuankun2，WangNa3

(1.SecondDepartmentofThoracicSurgery,FourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050011,China；2.JournalPress,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050017,China；3.DivisionofMolecularBiology,HebeiProvincialCancerInstitute,FourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050011,China)

ObjectiveTo research the effect of GANT61 on epithelial-mesenchymal transition (EMT) in human lung cancer H1703 and A549 cells lines,and to preliminarily investigate its action mechanism．MethodsDMSO was used as the control(DMSO group).After treating H1703 and A549 cells with GANT61 for 24 h,the gene changes of Gli-1,Gli-2,E-cadherin and Vimentin were detected by using the real time fluorescence quantitative PCR method.The influence of GANT61 on the expression of E-cadherin and Vimentin protein after acting on H1703 and A549 cells was observed by using the Western blotting assay.The scratch healing test was performed to evaluate the effect of GANT61 on the tumor cell invasion ability after acting on H1703 and A549 cells.ResultsThe real time fluorescence quantitative PCR showed that,compared with the DMSO group,GANT61 down-regulated the mRNA expression of Gli-1,Gli-2 and Vimentin mRNA of H1703 and A549 cell lines and elevated the expression of E-cadherin protein(P<0.01);the Western blotting showed that GANT61 down-regulated the expression of Vimentin of H1703 and A549 cell lines, and elevated the expression of E-cadherin(P<0.01)；the scratch healing test revealed the invasion ability of H1703 and A549 cells in the GANT61 treatment group was significantly decreased (P<0.01).ConclusionEMT in lung cancer is related with aberrant activations of Gli1 and Gli2 in Hedgehog signal transduction pathway,GANT61 could influence the EMT ability in lung cancer cells by down-regulating the expression of Gli-1 and Gli-2.Gli could become a new molecular target for inhibiting the lung cancer cell metastasis

lung cancer; Hedgehog signaling pathway; GANT61; Gli protein; epithelial-mesenchymal transition

王雷(1976-)，副教授，博士后，主要從事胸部腫瘤的靶向治療研究。

R734.2

A

1671-8348(2016)21-2903-03

2016-01-23

2016-04-10)

論著·基礎(chǔ)研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.21.007