王　莉，張　燕，余巨明，胡厚祥

(川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院：1.神經(jīng)內(nèi)科；2.心血管內(nèi)科，四川南充 637000)

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超低頻經(jīng)顱磁刺激對腦缺血大鼠認知功能的影響及機制*

王莉1，張燕1，余巨明1，胡厚祥2

(川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院：1.神經(jīng)內(nèi)科；2.心血管內(nèi)科，四川南充 637000)

目的研究超低頻經(jīng)顱磁刺激(TMS)對腦缺血大鼠認知功能的影響并探討其機制。方法將60只健康大鼠分為4組(各15只)：A組(假手術(shù)組)，B組(模型組)，C組(TMS組)和D組(TMS+H89組)。比較各組大鼠的逃避潛伏時間、跨越原平臺次數(shù)及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和巢蛋白(nestin)的表達水平。結(jié)果A組大鼠逃避潛伏期為(16.31±2.33)s，跨越原平臺次數(shù)為(8.02±1.76)次；B組大鼠逃避潛伏期為(57.14±2.89)s，跨越原平臺次數(shù)為(3.15±0.88)次；C組大鼠逃避潛伏期為(29.18±1.95)s，跨越原平臺次數(shù)為(5.44±0.75)次；D組大鼠逃避潛伏期為(45.87±2.06)s，跨越原平臺次數(shù)為(4.16±1.02)次。與A組比較，B、C、D組大鼠的逃避潛伏期明顯延長，且B組長于D組及C組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；大鼠的跨越原平臺次數(shù)明顯減少，且B組少于D組及C組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組大鼠VECF、BDNF和nestin表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論低頻TMS可以明顯改善腦缺血大鼠的認知功能，其作用與環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白及其下游基因(VEGF、BDNF)的表達有關(guān)。

經(jīng)顱磁刺激；腦缺血；認知功能

經(jīng)顱磁刺激(tanscranial magnetic stimulation，TMS)是一種利用脈沖磁場作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從容改變皮層神經(jīng)細胞的膜電位并引起一系列生理生化反應(yīng)，影響腦內(nèi)代謝和神經(jīng)電活動，改變腦可塑性的技術(shù)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，低頻TMS可以降低皮層的興奮性，促進精神、神經(jīng)疾病(如腦梗死)的恢復(fù)[2]，但其機制尚未研究明確。蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)可將其磷酸化成為活化形式，即磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(phosphorylated cAMP response element binding protein，pCREB)，而H89則可阻滯這種磷酸化作用。pCREB與靶基因啟動區(qū)DNA序列CRE(cAMP re-sponse element)結(jié)合，調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄。PKA-CREB信號通路與突觸的可塑性和學習記憶功能關(guān)系密切[3]。本研究旨在分析超低頻TMS對腦缺血大鼠認知功能的影響并探討其機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物選用60只健康的雄性Wistar大鼠作為實驗動物，體質(zhì)量為200～220 g，平均(210.4±6.2)g，由川北醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證號15-0212。將60只大鼠分為4組：A組(假手術(shù)組)15只，B組(模型組)15只，C組(TMS組)15只，D組(TMS+H89組)15只。

1.2儀器與試劑PKA抑制劑-H89 2HCl(美國Selleck公司)，大鼠單抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF，北京中杉金橋公司)，羊抗兔腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF，北京中杉金橋公司)，羊抗兔巢蛋白(nestin，美國SAB公司)，二抗(北京中杉金橋公司)。Morris水迷宮(長沙長錦科技有限公司)，圖像分析系統(tǒng)(北京益林苑科技有限公司)，Yrdccy-Ⅰ型磁刺激儀(武漢依瑞德公司)。

1.3方法

1.3.1腦缺血模型的制備及給藥參照文獻[4]大鼠右側(cè)大腦中動脈閉塞的造血模型建造方法構(gòu)建大鼠腦缺血模型(B、C、D組)；A組僅游離右側(cè)頸動脈但不給予封閉和結(jié)扎，手術(shù)過程嚴格遵循無菌原則，所有大鼠術(shù)后均采用無菌培養(yǎng)。D組大鼠在頭頂局部常規(guī)備皮、消毒，頭頂正中矢狀切開約1 cm，消毒后于前囟后0.8 mm、前囟所在矢狀線右側(cè)1.5 mm處鉆一小孔，緩慢進針至硬膜下4.5 mm，按照11.2 mg/kg劑量緩慢注射H89 2HCl，全部劑量分3次完成，注射過程持續(xù)5 min；C組大鼠給予等量生理鹽水。術(shù)后局部涂抹青霉素粉末，縫合消毒皮膚預(yù)防感染。

1.3.2磁刺激采用自制的固定裝置將C組和D組大鼠頭部固定于Yrdccy-Ⅰ型磁刺激儀(頻率：11 mHz；強度：500 Gs)的磁場區(qū)接受磁刺激，其余部位固定于非磁場區(qū)。每次15 min，每日1次，持續(xù)4周。A組和B組大鼠假刺激組同樣放置，但不接受磁刺激。

1.4觀察指標

1.4.1大鼠Morris水迷宮實驗大鼠于手術(shù)4周后進行Morris水迷宮實驗，包括定向航行實驗和空間搜索實驗。定向航行實驗：共進行5 d，9個時間段游泳訓練，記錄其尋找到平臺的時間記為逃避潛伏期，最長限制時間為120 s，若120 s內(nèi)未找到平臺，則逃避潛伏期記為120 s?？臻g探索實驗：在第5天下午記錄逃避潛伏后撤去平臺大鼠120 s內(nèi)跨越原平臺次數(shù)。

1.4.2大鼠海馬組織蛋白檢測于手術(shù)后1、2和4周分別取5只大鼠，采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)對大鼠海馬組織中的VEGF、BDNF、nestin和5-溴脫氧尿苷(BrdU)蛋白水平進行檢測：大鼠全部麻醉處死，斷頭取梗死側(cè)海馬，裂解、勻漿后取上清液，蛋白定量后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、電轉(zhuǎn)移和膜封閉，封閉結(jié)束后分別滴加1∶400大鼠單抗VEGF 、1∶300兔抗 BDNF、 1∶200兔抗Nestin和1∶200的兔抗Brdu，4 ℃孵育過夜。加入二抗室溫下于搖床孵育1 h，二抗孵育后顯色、曝光、顯影。測量并分析上述蛋白吸光度值，并以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參計算相對吸光度值(relative absorbances，RA)。

2　結(jié)　　果

2.1各組大鼠的認知功能比較各組大鼠的逃避潛伏期及跨越原平臺次數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1　　各組大鼠的認知功能比較±s)

*：P<0.05，與A組比較；#：P<0.05，與B組比較。

3.2各組大鼠腦組織VEGF及BDNF表達水平比較各組大鼠不同時刻腦組織VEGF及BDNF表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2　　不同時刻各組大鼠組織VEGF及BDNF表達水平比較±s)

*：P<0.05，與A組比較；#：P<0.05，與B組比較。

3.3各組大鼠腦組織nestin表達水平比較各組大鼠不同時刻腦組織nestin表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3　　不同時刻各組大鼠nestin表達水平比較±s)

*：P<0.05，與A組比較；#：P<0.05，與B組比較。

3　討　　論

研究發(fā)現(xiàn)，低頻TMS是一種通過刺激大腦皮層電位改變從而引起一系列生物活動的神經(jīng)電生理技術(shù)，具有穿透力強、非侵入性和無痛感等優(yōu)點[5]。本研究筆者旨在分析超低頻TMS對腦缺血大鼠認知功能的影響，并探討其機制。研究結(jié)果顯示，與A組(假手術(shù)組)大鼠相比，B、C、D組大鼠的逃避潛伏期延長，跨越原平臺次數(shù)減少，大鼠的認知功能下降。C組大鼠認知功能優(yōu)于B組(模型組)，說明超低頻TMS可以改善大鼠的認知功能；盡管與B組相比D組大鼠認知功能改善，但D組大鼠的認知功能明顯低于C組，說明PKA抑制劑-H89 2HCl可以在一定程度上阻斷TMS對腦缺血大鼠認知功能的改善作用。

對TMS改善大鼠認知功能的機制進行探討：VEGF是由內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的有絲分裂原，可以促進內(nèi)皮細胞的增殖并調(diào)控新生血管的形成。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF可以促進成年大鼠海馬區(qū)局部神經(jīng)的新生并改善大鼠的認知功能，抑制VEGF表達可以阻斷局部環(huán)境誘導(dǎo)的神經(jīng)新生[6-7]。BDNF是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛存在的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在神經(jīng)元的分化、發(fā)育、維持神經(jīng)元功能及修復(fù)等多發(fā)面發(fā)揮重要的作用，可以促進海馬神經(jīng)的再生和學習記憶功能的恢復(fù)[8]。

nestin主要在未分化和具有分裂能力的細胞中表達，在神經(jīng)系統(tǒng)中主要表達于神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)，隨著NSCs的分化，nestin表達水平逐漸降低并于細胞成熟后停止。因此，nestin表達水平可以反應(yīng)細胞的增殖水平[9-10]。在手術(shù)后1周，B、C、D組大鼠nestin水平較A組(假手術(shù)組)大鼠明顯升高，說明大鼠存在神經(jīng)干細胞的增殖，隨著細胞的分化和成熟，大鼠nestin表達水平下降。

既往研究發(fā)現(xiàn)，VEGF和BDNF均可以促進NSCs的增殖，VEGF的主要作用為早期促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)干細胞增殖[11]，而BDNF可以同時促進神經(jīng)干細胞的增殖和分化[12]。因此，VEGF和BDNF在腦缺血大鼠認知功能的恢復(fù)中發(fā)揮重要作用，均受PKA-CREB途徑的調(diào)控[13]。GREB作為一種核轉(zhuǎn)錄因子，其活化受PKA的調(diào)控。GREB磷酸化形式pGREB與靶基因啟動區(qū)DNA序列結(jié)合，從而調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄。PKA抑制劑-H89 2HCl可以通過抑制GREB的活化而抑制VEGF和BDNF的表達[14-15]。本次研究中，與C組大鼠相比，D組大鼠的VEGF、BDNF和認知功能均明顯下降，說明TMS可能通過調(diào)控PKA-GREB-BDNF/VEGF途徑改善大鼠的認知功能。但研究中，盡管D組大鼠的認知功能和nestin表達水平明顯低于C組，但仍高于B組，說明H89 2HCl不能完全阻斷TMS引起大鼠NSCs的增殖和分化，TMS還可以通過其他機制促進腦缺血大鼠的認知功能恢復(fù)。具體機制有待于進一步研究。

綜上所述，低頻TMS可以明顯改善腦缺血大鼠的認知功能，其作用與環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白及其下游基因(VEGF、BDNF)的表達有關(guān)。

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Influence of ultralow-frequency transcranial magnetic stimulus on cognitive ability of rats with cerebral ischemia and its mechanism*

WangLi1，ZhangYan1，YuJuming1，HuHouxiang2

(1.DepartmentofNeurology; 2.DepartmentofCardiology,AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China)

ObjectiveTo study the influence of ultralow-frequency transcranial magnetic stimulus(TMS) on the cognitive ability of rats with cerebral ischemia and its mechanism.Methods60 healthy rats were divided into 4 groups(15 cases each): A(sham-operation),B(model),C(TMS) and D(TMS+H89).The escape latency time,times of passing through platform,expression level of VEGF,BDNF and nestin protein were compared among 4 groups.ResultsIn the group A,the escape latency time was (16.31±2.33)s,times passing through platform were (8.02±1.76) times; in group B,which were (57.14±2.89)s and (3.15±0.88) times; in group C,which were (29.18±1.95)s and (5.44±0.75) times; in group D,which were (45.87±2.06)s and (4.16±1.02) times.Compared with the group A,the escape latency time in the group B,C and D was significantly extended,moreover that in the group B was longer than that in the group D and C,the differences were statistically significant(P<0.05); the times of passing through platform decreased,which in the group B was less than that in the group D and C,the differences had statistical significance(P<0.05).The expression levels of VEGF,BDNF and nestin had statistical differences among various groups(P<0.05).ConclusionLow-frequency TMS can significantly improve the cognitive ability of rats with cerebral ischemia,its effect is related to the expression of cAMP-response element binding protein and its following genes(VEGF and BDNF).

transcranial magnetic stimulus；cerebral ischemia；cognitive ability

國家自然科學基金資助項目(81070101)。作者簡介：王莉(1977-)，副教授，碩士，主要從事神經(jīng)內(nèi)科疾病研究。

R743.3

A

1671-8348(2016)21-2897-03

2016-01-25

2016-04-12)

論著·基礎(chǔ)研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.21.005