蔡第心，何鵬舉，譚洪波，丁　晶，余開富，張　穎，周田華，楊　軍，徐永清△

(1.昆明醫(yī)科大學骨科，昆明 650000；2.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院骨科,昆明 650000)

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Ⅱ型膠原糖胺聚糖復合支架對hUCMSCs成軟骨誘導的實驗研究*

蔡第心1，何鵬舉2，譚洪波2，丁晶2，余開富2，張穎2，周田華2，楊軍2，徐永清2△

(1.昆明醫(yī)科大學骨科，昆明 650000；2.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院骨科,昆明 650000)

目的探討以人臍帶間充質干細胞(hUCMSCs)作為軟骨組織工程種子細胞，Ⅱ型膠原復合糖胺聚糖支架材料作為細胞載體及其細胞-支架復合體成軟骨的可行性。方法制備Ⅱ型膠原復合糖胺聚糖多孔支架，電鏡觀察測定支架材料的孔徑、孔隙率和親水性，對支架材料進行相應的組織學分析。培養(yǎng)鑒定P3代的hUCMSCs，將hUCMSCs混懸液接種到Ⅱ型膠原復合糖胺聚糖支架上，不加誘導劑進行培養(yǎng)，3周后取出樣品行甲苯胺藍、番紅精O染色，Ⅱ型膠原免疫組織化學染色及掃描電鏡觀察。結果第3代hUCMSCs高度表達CD29、CD105等間充質細胞標志，幾乎不表達CD34等內皮細胞、造血細胞標志。Ⅱ型膠原復合糖胺聚糖支架材料呈白色多孔泡沫狀，孔隙率為(91.8±2.17)%，孔徑110～230 μm，分布均勻，相互貫通。吸水膨脹率為(213.71±1.31)%，親水性良好。甲苯胺藍、番紅精O及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色呈陽性。細胞-支架復合體在培養(yǎng)過程中可觀察到有軟骨樣組織形成并逐步增多，甲苯胺藍、番紅精O及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色均呈陽性，電鏡觀察顯示細胞在支架上增殖活躍，與材料黏附緊密，可見軟骨樣細胞及其周圍大量交錯連接的膠原纖維。結論hUCMSCs與Ⅱ型膠原復合糖胺聚糖支架材料復合，可在體外不經(jīng)誘導而初步構建組織工程軟骨，為軟骨損傷的修復奠定了一定的實驗基礎。

人臍帶間充質干細胞；種子細胞；糖胺聚糖；支架；組織工程軟骨

因創(chuàng)傷、腫瘤、結核及痛風等代謝性疾病引起軟骨缺損，從而導致的關節(jié)疼痛、關節(jié)活動受限，是骨科亟待解決的難題之一。目前，臨床上常見的治療方法如自體軟骨膜及骨膜移植、自體/異體骨軟骨移植等修復的軟骨大多為纖維軟骨，耐磨性差[1]，在生物和機械性能上與透明軟骨有著很大差別，應用效果不佳[2-3]。Vasiliadis等[4]發(fā)現(xiàn)，從人體非負重區(qū)取一小塊軟骨在體外培養(yǎng)3周后，移植入缺損區(qū)并覆蓋上骨膜，可以生成以Ⅱ型膠原為主的透明軟骨，在此基礎上衍生出了一種新的軟骨修復技術——基質誘導的自體軟骨細胞移植(matrix-induced autologous chondrocytes implantation,MACI)。MACI將軟骨細胞接種培養(yǎng)到生物相容性較好的三維生物材料支架上，再將其移植到缺損處修復軟骨缺損。但是，軟骨細胞的增殖潛力有限，經(jīng)過幾次體外的傳代培養(yǎng)后會逐漸去分化，失去軟骨細胞表型和再分化能力。間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有自我更新和多向分化的潛能，在組織工程細胞治療及基因治療等方面具有廣闊的研究及應用背景，被稱為是軟骨組織工程中最具研究價值的種子細胞[5]。Kasemkijwattana等[6]將骨髓MSCs移植到膠原支架上以治療骨性關節(jié)炎患者，取得了滿意的效果。單純的充質干細胞在體外誘導成軟骨的能力有限，并不能滿足組織工程化軟骨構建及軟骨缺損修復的要求。因此，構建組織工程軟骨不僅僅要有合適的種子細胞，還必須選擇一個合適的支架材料，為MSCs的黏附、生長提供必要的三維空間。本實驗在以往的研究基礎上，通過對軟骨組織進行脫細胞處理，制備多孔的Ⅱ型膠原復合糖胺聚糖軟骨支架材料，并將人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)移植到支架材料上，不使用誘導劑讓hUCMSCs向軟骨細胞分化，在支架材料上構建組織工程化軟骨，為制備仿生組織工程化軟骨，以及構建更加復雜的組織工程關節(jié)創(chuàng)造條件，并為之提供實驗基礎。

1　材料與方法

1.1細胞株來源原代hUCMSCs由成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院臨床試驗科細胞室提供。

1.2方法

1.2.1hUCMSCs的培養(yǎng)及鑒定將hUCMSCs轉移至細胞培養(yǎng)瓶中，向培養(yǎng)瓶中加入含有10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)基，在5% CO2、37 ℃恒溫、4%濕度的細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每日在顯微鏡下觀察細胞的生長情況。3 d后進行首次細胞換液，棄去未貼壁的細胞，此后3～4 d更換1次培養(yǎng)液。待細胞生長至貼壁覆蓋約80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)消化液消化，按1∶3比例進行傳代，將細胞分裝入新的培養(yǎng)瓶當中，置于5% CO2、37 ℃恒溫、4%濕度的細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每日在顯微鏡下觀察細胞生長、增殖情況及其形態(tài)變化。采用流式細胞儀檢測細胞表面標志物對hUCMSCs進行鑒定：分別取原代、第3代的細胞，用1∶1的2.5 g/L胰蛋白酶及0.2 g/L EDTA消化液消化，離心機1 200 r/min離心8 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細胞，制成細胞濃度為1×106/mL的細胞懸液，分別加入小鼠抗人單克隆抗體CD29-藻紅蛋白(PE)、CD44-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD34-PE、CD45-PE等各10 μL，充分搖勻，室溫下反應30 min，每管再加入PBS 1.5 mL，1 200 r/min離心5 min，棄上清液，每管加入PBS 100 μL重懸細胞，最后上機進行流式細胞儀檢測。

1.2.2Ⅱ型膠原糖胺聚糖支架的制作及鑒定在無菌潔凈工作臺上，用手術刀片切取新鮮的豬膝關節(jié)透明軟骨制作軟骨片，用4 ℃保存的PBS沖洗切取的豬膝關節(jié)軟骨片多次，之后將其放入含有蛋白酶抑制劑的Tris-HCl溶液中備用。將軟骨片置入攪拌器中，加入適量的冷藏的Tris-HCl緩沖液，3 000 r/min攪拌15 min，將得到的軟骨漿置入無菌容器內，分別加入配制好的Triton X-100液、蛋白酶抑制劑、消化酶液[1 U/mL牛胰核糖核酸酶A(RNase A)和50 U/mL脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ)混合液]，不斷地攪拌使其充分混勻，37 ℃過夜后，將其置于恒溫振蕩機(37 ℃)上震蕩24 h。將消化酶處理后的軟骨漿液置入高速離心機，7 000 r/min，4 ℃離心8 min，棄上清液，PBS徹底沖洗，將離心、沖洗步驟重復5次。去除多次離心、PBS沖洗后離心管內的上清液，將脫細胞后的軟骨基質漿液用PBS稀釋，濃度調制為30%，分別置于6孔培養(yǎng)板、24孔培養(yǎng)板內，將培養(yǎng)板置于冰凍干燥機中，-20 ℃預凍36 h，待其基本成形后，-80 ℃下冰凍干燥24 h。將支架材料刀片切割后掃描電鏡下觀察，測定支架材料的孔徑、孔隙率和親水性。進行支架材料的蘇木精-伊紅(HE)染色、番紅精O染色、甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠原免疫組織化學檢測，并在鏡下觀察。

1.2.3Ⅱ型膠原糖胺聚糖支架對hUCMSCs成軟骨的誘導將hUCMSCs培養(yǎng)至第3代，用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化液消化，1 200 r/min離心5 min，收集細胞，將細胞濃度調至2×107/mL。將鈷-60放射消毒滅菌后的Ⅱ型膠原復合糖胺聚糖支架置于培養(yǎng)板內，用注射器慢慢地將hUCMSCs懸液注射到支架材料上，使細胞均勻地覆蓋整個支架材料，加入含10% FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基完全浸潤支架，放入5% CO2、37 ℃恒溫、4%濕度的細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每日在顯微鏡下觀察細胞的黏附、生長、增殖及分化情況，3～4 d換1次，培養(yǎng)時間為12周。培養(yǎng)3周后取出部分標本，用10%的甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，然后用石蠟包埋，切片(5 μm厚度)，進行HE染色、甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠原免疫組織化學檢測，并在鏡下觀察。將hUCMSCs在Ⅱ型膠原及糖胺聚糖復合支架材料培養(yǎng)12周后取出，進行掃描電鏡觀察細胞的生長、繁殖及分化情況。

2　結　　果

2.1hUCMSCs的形態(tài)觀察及表面標志物測定傳代后的細胞生長能力明顯增強，顯微鏡下細胞呈均一的梭形生長，類似于成纖維細胞，呈典型的漩渦狀排列生長，細胞在傳代過程中形態(tài)并無明顯變化，在細胞傳至第3代時剩下形態(tài)較為單一的細胞(圖1A)，適用于流式細胞儀檢測。流式細胞儀檢測hUCMSCs免疫表型，結果顯示：原代培養(yǎng)的hUCMSCs已經(jīng)開始高表達CD44、CD90、CD105，但是仍有一定程度地表達CD34、CD45，而第3代的hUCMSCs則高度表達CD29、CD105等間充質細胞標志，幾乎不表達CD34等內皮細胞、造血細胞標志(圖1B、C、D)。

圖1　　第3代hUCMSCs的形態(tài)及免疫表型

2.2Ⅱ型膠原糖胺聚糖支架的形態(tài)觀察及鑒定制作好的Ⅱ型膠原復合糖胺聚糖復合支架材料為白色、多孔的泡沫狀圓柱體，可見支架材料的表面孔隙較多，刀片切開可見支架材料內部孔隙分布均勻，孔隙之間相互貫通(圖2A、B)。Ⅱ型膠原復合糖胺聚糖復合支架在掃描電鏡下觀察可見支架呈多孔泡沫狀，孔隙分布均勻，材料內空隙相互連通，孔徑平均，孔徑值在110～230 μm之間(圖2C)。支架孔隙率為(91.80±2.17)%，滿足軟骨組織工程學支架材料孔隙率的要求。支架吸水膨脹率為(213.71±1.31)%，顯示支架親水性良好。支架材料HE染色鏡下觀察顯示：支架材料呈多孔、多孔泡沫狀結構，孔徑均勻，孔隙之間相互貫通(圖3A)；甲苯胺藍染色陽性提示：支架材料中有糖胺聚糖存在(圖3B)；番紅精O染色陽性提示：支架材料中已無細胞成分存在(圖3C)；Ⅱ型膠原免疫組織化學染色陽性提示：將軟骨脫細胞處理后Ⅱ型膠原得到了極大的保存，它與糖胺聚糖是該支架材料的主要成分(圖3D)。

A:正面；B:側面；C:電鏡掃描(×5 000)。

圖2支架材料正側面及電鏡掃描結果

A：HE染色(×200)；B：甲苯胺藍染色(×200)；C：番紅精O染色(×200)；D：Ⅱ型膠原免疫組織化學染色(×200)。

圖3Ⅱ型膠原復合糖胺聚糖復合支架材料染色觀察結果

2.3Ⅱ型膠原糖胺聚糖支架對hUCMSCs成軟骨的誘導hUCMSCs在Ⅱ型膠原糖胺聚糖復合支架材料中培養(yǎng)3周后，即可肉眼觀察到支架材料表面有白色“軟骨樣”組織形成；第4周后，可明顯觀察到支架材料表面白色“軟骨樣”組織隨著培養(yǎng)時間延長較前明顯增多；第10周時，可觀察到白色“軟骨樣”組織覆蓋整個支架材料表面；培養(yǎng)滿12周后取出觀察為：乳白色軟骨樣組織，表面光滑，體積較支架材料稍增大，標本的彈性可，質稍軟(圖4)。誘導3周后的標本HE染色：鏡下可以觀察到支架表面黏附細胞數(shù)量較多，表明支架對細胞的黏附能力較強，并有片狀軟骨陷窩狀結構，有類軟骨樣組織形成(圖5A)；甲苯胺藍染色：呈強陽性反應，證明細胞外有大量膠原成分及糖胺聚糖生成(圖5B)；Ⅱ型膠原免疫組織化學檢測結果顯示：呈強陽性，說明有大量的軟骨細胞特異性成分(Ⅱ型膠原)生成(圖5C)。在掃描電鏡觀察下可見：細胞在支架材料上生長良好，與材料黏附緊密，細胞分裂增殖活躍，可見軟骨樣細胞及其周圍大量的膠原纖維，膠原纖維相互交錯連接(圖5D)。

圖4　　接種了hUCMSCs的Ⅱ型膠原糖胺聚糖支架體外成軟骨過程

A：HE染色(×200)；B：甲苯胺藍染色(×200)；C：Ⅱ型膠原免疫組織化學染色(×200)；D：掃描電鏡觀察(×100)。

圖5接種了hUCMSCs的Ⅱ型膠原糖胺聚糖支架(誘導3周)的染色觀察結果

3　討　　論

目前，MSCs在軟骨損傷修復方面已經(jīng)有了廣泛的應用，研究證實其具備向軟骨細胞分化的能力[7-8]。將各種來源的MSCs與軟骨細胞進行共培養(yǎng)顯示，其能分泌各種生物活性分子來促進軟骨細胞的增殖和細胞外基質的形成[9-10]。MSCs具有免疫調節(jié)特性，包括抑制細胞的增殖和分化，免疫調節(jié)其他的免疫細胞如自然殺傷細胞和巨噬細胞[11]。因此，如果要在臨床上廣泛使用MSCs，需要進行仔細的調查，行敏感測試，以確保達到安全的細胞治療的目的[12]。經(jīng)過多年的研究證實：hUCMSCs增殖、分化能力更強，免疫原性更低，安全性高，適合于廣泛的臨床運用[13]。本實驗證明了hUCMSCs是可以在短時間內快速擴增的，培養(yǎng)出來的細胞也可以正常穩(wěn)定地傳代，細胞形態(tài)及其增殖能力沒有明顯改變。流式細胞儀檢測結果表明：hUCMSCs高度表達CD29和CD105，幾乎不表達造血干細胞標志物，這與骨髓來源的MSCs相似，是目前較理想的軟骨組織工程種子細胞。

為了使MSCs向軟骨細胞定向分化，一般是在培養(yǎng)時加入各種生物活性分子如轉化生長因子β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、胰島素樣生長因子等進行誘導[14]。近年來有研究表明，天然軟骨來源的細胞外基質支架能在沒有外源性生長因子干預的條件下，誘導多能干細胞的成軟骨分化，認為直接的細胞-細胞外基質相互作用能顯著影響干細胞的表型表達和分化[15]。將MSCs培養(yǎng)于Ⅱ型膠原三維支架中，在沒有轉化生長因子-β1等生物活性分子的干預和誘導下，Ⅱ型膠原能夠上調SRY相關高遷移率組基因9(SRY-related high mobility group-box gene 9，Sox9)、Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖(aggrecan，AGG)、軟骨寡聚基質蛋白 (cartilage oligomeric matrix protein，COMP)和Ⅹ型膠原(collagen type Ⅹ，coll 10)的mRNA表達，促進MSCs的軟骨細胞相關表型表達，促進細胞合成Ⅱ型膠原和糖胺聚糖，誘導其成軟骨，這也表明MSCs能對特定的細胞外基質環(huán)境做出反應[16]。雖然關于生物活性分子對MSCs分化調節(jié)機制的研究很多，但是對細胞外基質如何調節(jié)MSCs分化機制的研究很少。一個可能的機制就是細胞外基質通過整合素受體對MSCs進行分化調控，整合素受體是介導細胞和其外環(huán)境的跨膜受體，阻斷特定的整合素受體后，可觀察到MSCs的成軟骨分化被抑制[17]。

將hUCMSCs與合適的生物材料支架復合，模擬天然軟骨細胞外基質結構和生化環(huán)境，可能進一步提高其成軟骨分化潛能。本實驗將P3代hUCMSCs接種到Ⅱ型膠原及糖胺聚糖復合支架上，并在體外進行非誘導劑下的培養(yǎng)。天然軟骨來源的細胞外基質支架材料在經(jīng)過實驗驗證后證實，該材料的成分與結構和天然軟骨類似，所以能夠更好地模擬軟骨細胞的細胞外基質環(huán)境，有利于軟骨細胞的生長、增殖及表型維持。因此，它可以作為未來軟骨組織工程研究的一個方向。本實驗培養(yǎng)出的軟骨組織標本HE染色、甲苯胺藍染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學檢測均為陽性，鏡下可以觀察到片狀軟骨陷窩狀結構，有類軟骨樣組織形成，細胞外有大量Ⅱ型膠原成分及糖胺聚糖生成。但是，本實驗培養(yǎng)出的軟骨在力學性能上欠佳，質軟。因此，如何在非誘導條件下，使hUCMSCs能夠在體外構建更為成熟的組織工程軟骨還需要進一步的研究。筆者構建的組織工程軟骨在體外培養(yǎng)時間較短，長期培養(yǎng)后hUCMSCs是否會出現(xiàn)去分化現(xiàn)象，移植入體內后是否可以形成軟骨組織尚不清楚，這也需要進一步的研究。但是筆者確信，隨著研究的不斷深入，組織工程軟骨必會表現(xiàn)出其良好的應用前景。

綜上所述，本文hUCMSCs經(jīng)檢測顯示符合MSCs的基本生物學特性，可以作為軟骨組織工程良好的種子細胞來源，而Ⅱ型膠原復合糖胺聚糖支架材料具備適合細胞生長、增殖的孔徑和孔隙率，親水性及生物相容性良好，可以作為軟骨組織工程良好的細胞載體，將兩者復合可在體外不經(jīng)誘導而初步構建組織工程軟骨，為軟骨損傷的修復奠定了一定的實驗基礎。

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Experimental research of type Ⅱ collagen composite glycosaminoglycan scaffold in hUCMSCs chondrogenic induction*

CaiDixin1，HePengju2，TanHongbo2，DingJing2，YuKaifu2，ZhangYing2，ZhouTianhua2，YangJun2，XuYongqing2△

(1.DepartmentofOrthopedics,KunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650000,China；2.DepartmentofOrthopedics,KunmingGeneralHospitalofChengduMilitaryRegion,Kunming，Yunnan650000,China)

ObjectiveTo investigate the chondrogenic feasibility of the human umbilical cord derived mesenchymal stem cells(hUCMSCs)as cartilage tissue engineering seed cells,type Ⅱ collagen composite glycosaminoglycan scaffold as the cellular carrier and cell-scaffold complex.MethodsThe type Ⅱ collagen composite glycosaminoglycan scaffolds was prepared.The pore diameter,porosity and hydrophilia of scaffold materials were observed and measured by electronic microscope.The corresponding histological analysis on the scaffold materials was performed.hUCMSCs of P3 generation were cultured and identified.The hUCMSCs suspension was inoculated in the type Ⅱ collagen composite glycosaminoglycan scaffold for conducting culture without adding inducer.The samples were taken out after 3 weeks and performed the toluidine blue and safranin O staining,type Ⅱ collagen immunohistochemical staining and SEM scanning.ResultshUCMSCs of P3 generation highly expressed the mesenchymal cell marker CD29 and CD105,while hardly expressed endothelial cells of CD34 and hematopoietic cell markers.The type Ⅱ collagen composite glycosaminoglycan scaffold presented white porous foam like,the porosity was (91.8±2.17)%,the average pore diameter was 110-230 μm,which was homogeneously distributed and had interpenetration.The scaffold showed good hydrophilicity with the water absorption expansion rate of (213.71±1.31)%.The scaffold staining of toluidine blue,safranin O and type Ⅱ collagen was positive.The cartilage-like tissues were observed,and gradually increased in the surface of cell-scaffold complex along with culture,which were positive in Toluidine blue,safranin O and type Ⅱ collagen staining,the electronic microscopic observation displayed that the cells were actively proliferated in the scaffold,closely adhered with the materials,the cartilage-like cells and a large number of peripheral collagen fibers with zigzag connection could be seen.ConclusionCompositing hUCMSCs and type Ⅱ collagen composite glycosaminoglycan scaffold could construct tissue-engineering cartilage in vitro without induction,which lays a certain experimental foundation for the repair of cartilage damage.

human umbilical cord mesenchymal stem cells；seed cells；glycosaminoglycan；scaffold；tissue-engineering cartilage

國家自然科學基金資助項目(81360274)；第57批博士后科學基金面上資助項目(2015M572718)；云南省應用基礎研究自籌經(jīng)費項目(2014F2106)；成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院院管項目(2012YG12)。作者簡介：蔡第心(1986-)，住院醫(yī)師，在讀博士，主要從事骨與軟骨組織工程研究?！?/p>

，E-mail：xuyongqingkm@163.net。

R318

A

1671-8348(2016)21-2890-04

2016-01-27

2016-04-14)

論著·基礎研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.21.003