李鳳林，羅志福，樊彩云，劉子華，鄧新榮

(中國原子能科學研究院 同位素研究所，北京　102413)

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巰基十二硼烷二鈉鹽的急性毒性與藥代動力學研究

李鳳林，羅志福，樊彩云，劉子華，鄧新榮

(中國原子能科學研究院 同位素研究所，北京102413)

摘要：本研究采用210、300、430、614 mg/kg四個劑量對巰基十二硼烷二鈉鹽(BSH)進行了急性毒性實驗，得到其半數(shù)致死量(LD50)為381.94 mg/kg，LD50的95%置信區(qū)間為[334.97 mg/kg，435.51 mg/kg]。進行BSH的藥代動力學初步研究，根據(jù)給藥后得到的藥時曲線，選用三房室模型擬合得到BSH的半衰期分別為t1/2α=3.6 min、t1/2β=55.8 min、t1/2γ=6.26 h；表觀分布容積Vd為3 523.58 mL/kg、藥時曲線面積AUC為247.55 hr*μg/mL、清除率CL為3 572.45 mL/hr/kg。在小鼠體內的生物分布結果表明，BSH在血液中清除較快，各器官在注射后30 min達到最大攝取，其在體內主要通過腎臟排泄。以上研究結果可為BSH在國內臨床應用的安全性提供實驗基礎。

關鍵詞：BNCT；BSH；急性毒性；藥代動力學；生物分布

硼中子俘獲療法(boron neutron capture therapy, BNCT)是一種二元靶向放療方法，將含10B的藥物通過口服或注射方法引入體內，并使之選擇性地聚集在癌細胞中，然后用中子照射病變部位，使10B 發(fā)生10B (n,α)7Li 核反應，利用產(chǎn)生的α粒子和7Li 粒子殺死癌細胞[1]。這些粒子均屬高傳能線密度(linear energy transfer, LET)射線，具有能量高和射程短的特點，產(chǎn)生的α粒子能量可達1.7 MeV，平均LET為200 keV/μm，因此，BNCT需每個癌細胞含有109個10B[1]。Li與α粒子的射程分別為4 μm和9 μm(腫瘤細胞的直徑<10 μm)，因此在其射程空間內發(fā)生的電離反應可殺傷吸收硼化物的癌細胞及與之相鄰的細胞，而對正常的組織損害小。目前，BNCT是治療惡性腦膠質瘤最有效的方法之一[2]。

硼攜帶劑(含硼藥物)是BNCT能否成功的重要條件之一，良好的硼攜帶劑可被癌細胞選擇性吸收，達到靶向給藥的目的。對二羥硼苯丙氨酸(p-Boronophenylalanine, BPA)和巰基十二硼烷二鈉鹽(sodium undecahydro-mercapto-closo-dodecacarborate，BSH)毒副作用很小，在治療劑量范圍內未見化學中毒的報道。BSH是硼簇類化合物，其在生物環(huán)境下具有良好的水解和代謝穩(wěn)定性，含硼量高，在相同的劑量水平下與BPA相比，能夠載帶更多的10B至腫瘤組織，是目前最有效的BNCT藥物之一[3-4]。

1967 年Soloway[5]等合成了BSH，1968年Hatanaka[6]最先將其用于BNCT。1968年到1997年，Hatanaka項目組在日本采用熱中子BNCT共治療腦腫瘤患者149例，計164次，報道中38例Ⅲ-Ⅳ級的膠質瘤患者，5年和10年生存率分別為19%和10%。38例中的16例腫瘤冠狀面在6 cm內，5年和10年生存率分別為58%和29%[7-8]。其他類型的腦腫瘤患者的生存期也不同程度的得到了提高。Masunaga等[9]對28 例膠質母細胞瘤患者術前靜脈注射50 mg/kg的BSH，測得腫瘤組織與非腫瘤組織的BSH攝取比一直大于3，在腫瘤組織與血液中的濃度比(T/B)約為2.5。目前，美國、德國、日本、芬蘭、挪威、瑞典等國家均先后開展了BSH的Ⅰ期或Ⅱ期臨床實驗，其治療領域也在不斷擴大，如治療黑色素瘤、甲狀腺癌和口腔癌等[9-10]。本文根據(jù)相關文獻[12-15]，對BSH的急性毒性、藥代動力學進行初步研究，并進行BSH在正常小鼠體內的生物分布實驗，以確定BSH在體內的代謝途徑、代謝毒性等信息，擬為該化合物在國內的臨床應用提供一定的實驗依據(jù)。

1　實驗材料

1.1主要試劑

3-甲氧基-甲亞胺H：上海金圣化工有限公司產(chǎn)品；鹽酸、氫氧化鈉、氨水、乙酸、乙酸胺、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、濃硝酸、雙氧水、抗壞血酸、注射用生理鹽水等均為國藥集團化學試劑北京有限公司產(chǎn)品；BSH：白色粉末狀，純度>99%，本實驗室根據(jù)文獻[11]自行合成，結構經(jīng)核磁、質譜驗證結構。

1.2主要儀器

移液器(100～1 000 μL)：Socorex產(chǎn)品；移液器(1～5 mL)：芬蘭Finnpipette；211型pH計：Orion Research產(chǎn)品；UV2450型紫外-可見分光光度計：日本導津；TGL-16L型離心機：上海安亭科學儀器廠；AR2130電子天平：梅特勒-托利多儀器(上海有限公司)；手術器械、一次性無菌注射器等北京大學醫(yī)學部。

1.3實驗動物

昆明小鼠，18～20 g，SD大鼠，180～200 g，均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2014-0004。

2　實驗方法

2.1BSH急性毒性

通過預實驗確定正式實驗選取50只小鼠，雌雄各半，隨機分為五組，一組為空白對照組，其余四組按210、300、430、614 mg/kg四個劑量(各組劑間比為0.7)分別尾靜脈注射BSH注射液，空白對照組尾靜脈注射生理鹽水，給藥后連續(xù)觀察14 d。觀察記錄動物毒性反應情況，記錄每組小鼠死亡數(shù)，剖檢死亡小鼠，肉眼觀察各主要臟器有無明顯變化，臟器出現(xiàn)體積、顏色、質地等改變時，記錄并進行病理組織學檢查。存活小鼠連續(xù)觀察14 d后處死，剖檢，肉眼觀察主要臟器有無明顯變化，臟器出現(xiàn)體積、顏色、質地等改變時，保存異常臟器標本，并保留空白對照組的同一臟器標本進行病理組織學比較檢查。

2.2BSH藥代動力學

2.2.1注射劑量

參考BSH臨床用藥途徑，選用靜脈注射給藥方式。根據(jù)急性毒性實驗結果，設計BSH靜脈注射給藥的低劑量組為62.5 mg/kg，中劑量組為125 mg/kg，高劑量組為250 mg/kg。

2.2.2溶液配制

(1) BSH注射液。準確稱取BSH 適量，加生理鹽水溶解稀釋至所需濃度，使低劑量濃度為25 mg/mL，中劑量濃度為50 mg/mL，高劑量濃度為100 mg/mL。所配溶液過0.22 μm無菌濾膜過濾，備用。

(2) 3-甲氧基-甲亞胺H溶液。稱取0.27 g 3-甲氧基-甲亞胺H，用0.5 mol/L NaOH溶液完全溶解，再加入0.6 g抗壞血酸，用HCl調節(jié)pH為5.7±0.2，定容至30 mL，聚丙烯瓶中保存。

(3) 乙酸-乙酸胺緩沖溶液。稱取100.0 g乙酸胺溶于400 mL蒸餾水中，并加入冰醋酸28 mL調節(jié)溶液pH為5.7±0.2，加水定容至500 mL。

(4) EDTA溶液(2%)。稱取1.0 g EDTA，加40 mL蒸餾水加熱溶解，用4 mol/L NaOH溶液調節(jié)pH至8，定容至50 mL。

2.3.3實驗分組

取大鼠18只，隨機分成高、中、低3個劑量組，每組6只。各劑量組BSH濃度分別為250、125、62.5 mg/kg。大鼠尾靜脈注射給藥0.5 mL，分別于0 min(藥前)和5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、6 h、9 h(藥后)，眼底靜脈叢采血，每次0.8 mL～1.0 mL，采血后4 000 r/min離心5 min制備血清，分裝2管，每管0.15 mL，-20 ℃保存，備用。

2.3.4血藥濃度檢測

(1) 生物樣品處理

取血清0.15 mL加50 μL水潤濕，加0.5 mL濃硝酸消解過夜，再加0.2 mL H2O2繼續(xù)消解，待無氣泡產(chǎn)生時，于100 ℃加熱至溶液近干，待測。

取組織先制成勻漿，然后稱取質量不大于0.1 g的樣品，加50 μL水潤濕，加0.5 mL濃硝酸消解過夜，再加0.2 mL H2O2繼續(xù)消解，待無氣泡產(chǎn)生時，于100 ℃加熱至溶液近干，待測。

(2) 血清標準曲線

準確稱取一定量BSH，分別配制BSH濃度為334、167、83.5、41.75、20.88 μg/mL的系列標準溶液。依次吸取上述標準溶液0.1 mL分別置于5個離心管中，用水做空白，依次加入0.15 mL鼠血清，充分混勻，按消解血清的方法消解后，依次加入0.25 mL EDTA溶液，0.5 mL乙酸-乙酸胺緩沖溶液，0.5 mL 3-甲氧基-甲亞胺H溶液，加水稀釋至2.5 mL，反應40 min后，于430 nm處測量吸光度，得標準曲線y=0.136 15x+0.018 64，R2=0.999，線性關系良好。依據(jù)此標準曲線，待測生物樣品濕法消解后，即可用已建立的3-甲氧基-甲亞胺H為顯色劑的紫外-可見分光光度法測定生物樣本中BSH的含量[16]。

2.3.5BSH在正常小鼠體內生物分布

取昆明小鼠30只，隨機分為6組，每組5只，其中一組為空白組，不注射BSH溶液，其余5組每只小鼠經(jīng)尾靜脈注射BSH注射液100 μL(BSH 的注射劑量為100 mg/kg)，分別于給藥后5 min、30 min、1 h、2 h和3 h斷頸處死動物，取血及心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、腦和頭皮等組織，濕法消解后按配制標準曲線的方法配制待測溶液，用已建立的紫外-可見分光光度法測量各組織中的硼含量，計算單位質量組織中攝取的BSH量(以μg B/g組織表示)。所得結果進行統(tǒng)計學分析，得出BSH在小鼠體內的生物分布。

2.3.6數(shù)據(jù)處理及藥代動力學參數(shù)計算

實驗數(shù)據(jù)采用winnonlin5.2藥代動力學軟件擬合分析，計算得到BSH的主要藥代動力學參數(shù)，t1/2為消除半衰期，Vd為表觀分布容積，AUC為血藥濃度-時間曲線下面積，CL為清除率等。

3　結果與討論

3.1BSH急性毒性

3.1.1BSH給藥后臨床指征

614 mg/kg劑量組給藥后動物呼吸急促，有強直性抽搐，翻正反射消失，無眼瞼反射，全部即刻死亡，解剖后肺部有稍許充血現(xiàn)象，其他臟器無明顯異常；430 mg/kg劑量組給藥后5 min至5 h內共有7只動物死亡，該7只小鼠給藥后呼吸急促，有強直性抽搐，翻正反射消失，部分小鼠給藥后幾小時內仍有微弱呼吸，有眼瞼反射，但5 h內均相繼死亡，解剖后各臟器無明顯異常；成活的3只小鼠給藥后亦出現(xiàn)呼吸急促，強直性抽搐現(xiàn)象，有翻正反射，放回籠中仍俯臥不動，成困倦昏睡狀態(tài)，但對外界刺激有反應，幾小時后恢復正常狀態(tài)直至14天觀察期結束。300 mg/kg劑量組給藥后只有1只小鼠呼吸急促，俯臥震顫，翻正反射消失，2 min后死亡，解剖后各臟器無明顯異常，其余小鼠給藥后，呼吸、運動等功能均正常，給予水、糧后正常飲水進食，未出現(xiàn)明顯中毒跡象；210 mg/kg劑量組和空白對照組給藥后，全部小鼠呼吸、運動等功能均正常，給予水、糧后正常飲水進食，未出現(xiàn)中毒跡象。

3.1.2BSH給藥后死亡情況和數(shù)據(jù)統(tǒng)計

根據(jù)BSH給藥后死亡率數(shù)據(jù)(見表1)，用寇氏法計算BSH的半數(shù)致死率(LD50)為381.94 mg/kg，LD50的95%置信區(qū)間為[334.97 mg/kg，435.51 mg/kg]。各劑量組小鼠給藥后，存活動物在整個觀察期間，毛色、呼吸、運動、飲水進食、排泄等狀態(tài)均正常，與空白對照組體重增長無顯著性差異。

表1　BSH給藥后死亡及體重變化情況Table 1　The statistics of death and weight of the mice after BSH injection

3.1.3BSH給藥后解剖和病理切片檢查

BSH在給藥后除去即刻死亡及第2天死亡的動物，在連續(xù)觀察期中沒有再出現(xiàn)動物死亡，觀察期結束后對所有劑量組小鼠進行解剖，部分小鼠在打開胸腔時肺部出現(xiàn)血塊，614 mg/kg劑量組小鼠、300 mg/kg劑量組雄鼠5號以及210 mg/kg劑量組雄鼠4號脾臟與其他小鼠脾臟相比較大，614 mg/kg劑量組1號小鼠腎臟部分疑似有充血現(xiàn)象，且腎盂顏色發(fā)暗，其余小鼠無肉眼可見性異常及病變。將發(fā)現(xiàn)病變小鼠的組織及高劑量組即614 mg/kg劑量組小鼠心、肝、脾、肺、腎、胃、腦等臟器用4%福爾馬林固定，同時取空白對照組小鼠相應器官，送檢做病理切片檢驗，臟器切片對比圖示于圖1。送檢的病理切片結果顯示，614 mg/kg劑量組肝臟的肝竇有輕度充血、見到轉移紅細胞、中央靜脈擴張，肝細胞出現(xiàn)小葉，提示高劑量組BSH對小鼠肝臟造成一定毒性影響；614 mg/kg劑量組脾臟的巨噬細胞數(shù)量有所增多、腎小球毛細血管充血且腎球囊有纖維素滲出；614 mg/kg劑量組小鼠大腦噬神經(jīng)元內有膠質細胞侵入，神經(jīng)元細胞體積稍有增大、胞漿基質增多，表明高劑量BSH對神經(jīng)元有一定毒性。由以上結果提示，BSH可能的毒性靶器官為腎臟、脾臟、肝臟、中樞神經(jīng)元。

3.2BSH藥代動力學分析

用winnonlin5.2藥代動力學軟件進行數(shù)據(jù)處理，得到BSH注射溶液(125 mg/kg)靜脈注射后的BSH藥物濃度-時間曲線示于圖2。由圖2可見，BSH在體內代謝呈三房室模型[15]，并由此擬合分析BSH的相關藥代動力學參數(shù)。

圖1　BSH給藥后主要臟器病理切片對比圖Fig.1　The compare of pathology slice of main organs after injecting BSH

圖2　BSH藥物濃度-時間曲線(n=6)Fig.2　The concentration-time curve of BSH (n=6)

用winnonlin5.2藥代動力學軟件，擬合分析所得到的BSH的相關藥代動力學參數(shù)列于表2，由此得到BSH在體內的半衰期分別為t1/2α=3.6 min、t1/2β=55.8 min、t1/2γ=6.26 h；表觀分布容積Vd為3 523.58 mL/kg、藥時曲線面積AUC為247.55 h*μg/mL、清除率CL為3572.45 mL/h/kg。藥代動力學參數(shù)表明，BSH在體內吸收、消除均比較快，在62.5～250 mg/kg劑量范圍內，其在大鼠體內的動力學過程呈線性動力學特征。

3.3BSH在正常小鼠體內生物分布

給藥后，BSH在小鼠體內主要器官的單位質量組織中攝取的硼濃度列于表3。由表3可以看出，尾靜脈注射BSH后，各器官在注射后30 min達到最大攝取，血，腎，腸，頭皮中攝取較高，在血液中清除較快；腎中分布較高，表明BSH主要通過泌尿系統(tǒng)排泄；頭皮中含量較高，與文獻報道吻合。

表2　BSH藥代動力學參數(shù)Table 2　The pharmacokinetics parameter of BSH

表3　BSH在正常小鼠體內生物分布Table 3　The biodistribution of the BSH in normal mice ±s, n=5)

4　結論

本文對所合成BSH進行了急性毒性研究和大鼠體內藥代動力學研究，得到了BSH的半數(shù)致死量LD50為381.94 mg/kg，該數(shù)據(jù)為BSH臨床用藥的劑量設計提供了實驗依據(jù)；病理切片結果提示BSH給藥后潛在的毒性靶器官為腎臟、脾臟、肝臟、中樞神經(jīng)元等，因此該藥物臨床給藥后應重點監(jiān)測這些器官的生理生化變化，以評估該藥物對這些器官造成的可能的損傷以及需要采取的預防保護措施；在大鼠內的藥代動力學研究表明，BSH在動物體內消除符合三房室模型，得到了相關的藥代動力學參數(shù)，所得參數(shù)與相關文獻[12-15]報道基本吻合，數(shù)據(jù)顯示BSH在大鼠體內吸收、分布、消除較快，在62.5～250 mg/kg劑量范圍內，體內動力學呈線性動力學特征；生物分布實驗表明，BSH血液中清除較快，各器官在注射后30 min達到最大攝?。荒I臟，腸，頭皮中的攝取相對較高，腎臟攝取較高說明BSH主要通過泌尿系統(tǒng)排泄，腸道攝取較高表明BSH部分進入消化系統(tǒng)代謝，頭皮攝取較高可能與BSH分子中含有巰基有關。以上研究揭示了BSH在體內的吸收、分布、代謝以及毒性信息，為BSH在國內臨床應用的安全性提供實驗基礎。

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收稿日期：2016-02-17;修回日期：2016-03-17

作者簡介：李鳳林(1983—)，女，山東濰坊人，助理研究員，放射性藥物專業(yè) 通信作者：羅志福，研究員，E-mail: luozhifu@ciae.ac.cn

中圖分類號：R817

文獻標志碼：A

文章編號：1000-7512(2016)03-0164-06

doi：10.7538/tws.2016.29.03.0164

The Acute Toxicity and Pharmacokinetics of the BSH

LI Feng-lin，LUO Zhi-fu, FAN Cai-yun, LIU Zi-hua, DENG Xin-rong

(theDepartmentofIsotopes,ChinaInstituteofAtomicEnergy,Beijing102413,China)

Abstract:In this study, the acute toxicity of BSH was studied at doses of 210, 300, 430, 614 mg/kg, and the LD50was calculated at 381.94 mg/kg. A three-compartment model system was used to evaluate the pharmacokinetics of the BSH, and the pharmacokinetic parameters, such as t1/2，Vd, AUC, CL of BSH were calculated: t1/2α=3.6 min, t1/2β=55.8 min, t1/2γ=6.26 h, Vd=3 523.58 mL/kg, AUC= 247.55 hr*μg/mL, CL=3 572.45 mL/hr/kg. The biodistribution of the BSH was studied in normal mice, from which the characteristics of biodistribution of BSH was analyzed.

Key words：BNCT; BSH; acute toxicity; pharmacokinetics; biodistribution