蹇　源，周志軍，卓連剛，趙　鵬，廖　偉，王關(guān)全，劉　寧

(1.四川大學 原子核科學技術(shù)研究所 輻射物理及技術(shù)教育部國家重點實驗室，四川 成都　610064；2.中國工程物理研究院，四川 綿陽　621900)

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寡聚對苯乙炔與多肽拮抗劑RM26的偶聯(lián)及131I標記研究

蹇源1,2，周志軍2，卓連剛2，趙鵬2，廖偉2，王關(guān)全2，劉寧1

(1.四川大學 原子核科學技術(shù)研究所 輻射物理及技術(shù)教育部國家重點實驗室，四川 成都610064；2.中國工程物理研究院，四川 綿陽621900)

摘要：結(jié)合寡聚對苯乙炔(oligo p-phenylene ethynylene, OPE)較強細胞膜穿透能力和多肽拮抗劑RM26對PC-3癌細胞的高親和性，設計合成OPE-RM26偶聯(lián)物。采用Iodogen涂管法對偶聯(lián)物進行131I標記，得到標記率為95%的放射性標記物131I-OPE-RM26，室溫下放置24 h后其放化純度仍大于90%，具有良好的體外穩(wěn)定性。研究結(jié)果為制備具有靶點識別、膜穿透性、射線殺傷的多功能放射性藥物提供參考。

關(guān)鍵詞：寡聚對苯乙炔；多肽拮抗劑；偶聯(lián)反應；131I標記

2005年，美國新墨西哥州大學的Lu等[1]首次報道了一種對細菌具有光誘導殺傷作用的聚苯乙炔衍生物(poly phenylene ethynylene，PPE)，該發(fā)現(xiàn)引起了關(guān)注，并進行了進一步研究[2-5]。Zhou等[6]發(fā)現(xiàn)寡聚對苯乙炔(oligop-phenylene ethynylene, OPE)具有出色的抗菌性能；Wang等[7]利用電子/光學顯微鏡和小角X射線散射(SAXS)技術(shù)研究黑暗條件下PPE和OPE對大腸埃希氏菌(Escherichiacoli,E.coli)的抗菌行為，結(jié)果顯示PPE改變了細菌外層膜結(jié)構(gòu)并導致細菌膜塌陷，OPE插入細菌膜使內(nèi)溶物釋放出來導致細菌破裂。

腫瘤細胞與正常細胞具有明顯不同的分子生物學特征，很多腫瘤細胞會過度表達一些生物分子[8-10]。促胃泌素多肽受體(GRP-R)在早期的新腫瘤細胞和侵入式前列腺癌細胞中均過度表達，比正常組織高出20倍左右[11]。因此，以癌細胞的GRP-R為靶點，GRP類似物為靶向基團，通過放射性同位素標記，合成能專一識別癌細胞GRP-R的放射性藥物具有積極意義。目前，部分GRP-R激動劑完成了臨床前研究，99mTc標記藥物已經(jīng)應用于單光子發(fā)射計算斷層掃描(SPECT)顯像[12-13]；以18F和64Cu 標記的正電子發(fā)射斷層掃描(PET)分子顯像藥物也已進入臨床實驗階段[14]。但是基于GRP 受體識別治療用放射性藥物研究進展較為緩慢，Lantry等[15]合成了一種改進的GRP類似物，在臨床實驗中表現(xiàn)出一定的治療潛力，但其劑量高(1.4～4 μg/kg)，在胰腺中高濃度富集，副作用較大[16]；Ginj等[11,17]發(fā)現(xiàn)，雖然多肽拮抗劑不能有效地內(nèi)化，但具有更高的受體親和性與更低的檢出限，據(jù)此合成放射性標記的拮抗劑demobesin 1，其體內(nèi)性質(zhì)優(yōu)于99mTc標記的激動劑藥物demobesin 4；Mansi等[18]研究激動劑111In-DOTA-AMBA和拮抗劑111In-DOTA-RM1對裸鼠的抗癌性能(PC-3)，結(jié)果顯示111In-DOTA-RM1在腫瘤攝取、腫瘤/正常組織放射性攝取比以及藥物的腫瘤滯留時間等方面優(yōu)于111In-DOTA-AMBA；Kroll等[19]合成了包含GRP-R激動劑(AMBA)和拮抗劑(RM1)雙功能基的分子，通過調(diào)控AMBA和RM1的距離，得到具有激動劑和拮抗劑雙重優(yōu)點的新型治療藥物。

為獲得具有靶點識別、膜穿透性、射線殺傷的放射性藥物，本研究擬將具有細胞膜穿透性的OPE分子與多肽拮抗劑RM26偶聯(lián)后進行I-131標記，研究該放射性藥物的穩(wěn)定性，為新型放射性藥物研發(fā)提供參考。

1　實驗材料

1.1儀器

Mini-Scan型TLC薄層放射性掃描儀：美國Bioscan公司；微量電子天平：AE200，瑞士 Ettler公司；電子天平：JA2003A，上海精天電子儀器有限公司。

1.2試劑

Na131I(1.48×1012Bq /L)：成都中核高通公司； 寡聚對苯乙炔(OPE)：本項目組合成，并經(jīng)核磁共振(NMR)和質(zhì)譜(MS)表征；(Tyr)3-RM26：安徽國泰公司合成；放射性薄層層析紙：Whatman No. 1紙；其他試劑均為分析純，Aladdin試劑公司提供。

2　實驗方法

2.1OPE-RM26合成

寡聚對苯乙炔(OPE)分子結(jié)構(gòu)示于圖1。OPE-RM26的合成路線示于圖2。稱取(Tyr)3-RM26(32 mg, 0.017 mmol)溶解于水和乙腈的混合溶劑(V水∶V乙腈=1∶1)中，加入0.034 mmol的縮合劑BOP(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate)或EDI((N1-((ethylimino)methylene)-N3,N3-dime-thylpropane-1,3-diamine))和0.085 mmol的DIAP(Di-Isoamyl Phosphate)，室溫下攪拌30 min，加入EO-OPE(NH2)(10 mg, 1.2 mmol)，室溫下反應過夜。

圖1　OPE分子結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1　Schematic structures of the OPE molecular

圖2　OPE-RM26的合成路線Fig.2　Synthesis method of OPE-RM26

2.2OPE-RM26放射性標記

將0.1 mg OPE-RM26或(Tyr)3-RM26溶解于100 μL NaH2PO4/Na2HPO4緩沖溶液中(pH=5.2)，得到1 g/L的待標溶液。取適量Iodogen(1,3,4,6-四氯-3A,6A-二苯基八氫咪唑并[4,5-D]咪唑-2,5-二酮)溶解于含二氯甲烷的離心管中，真空狀態(tài)下快速抽干溶劑，依次加入100 μL待標化溶液(OPE-RM26或(Tyr)3-RM26)，10 μL Na131I(9.62×106Bq)溶液。10 min后取10 μL反應液，分別點樣在Whatman紙和硅膠板上，并在不同展開體系展開后用TLC薄層儀掃描計數(shù)，計算標記物的放化純度。用pH=5.2緩沖溶液浸潤C-18柱后加入反應體系溶液，用相同緩沖溶液淋洗直至不再有放射性活度，得到水相，將淋洗液換為乙醇，淋洗2 mL后測量各相放射性活度，計算標記率。為優(yōu)化標記條件，考察pH、反應時間、溫度、多肽用量對標記率的影響。

2.3標記物體外穩(wěn)定性

取0.15 mL I-131標記的多肽溶液(約9.62×106Bq)，用1 mL 0.9% NaCl溶液稀釋，20 ℃下放置24 h。采用2.2中方法計算放化純度，考察標記化合物的體外穩(wěn)定性。

3　結(jié)果與討論

3.1OPE-RM26合成

半制備HPLC分離(Agilent 1100，H2O∶90%～40%，CH3CN：10%～60%)，冷凍干燥后得到白色固體粉末26.8 mg，產(chǎn)率：72%。MS ESI測定相對分子質(zhì)量M+2H+為:2 420.02。

多次OPE與多肽的偶聯(lián)反應結(jié)果表明，常規(guī)的偶聯(lián)劑如HATU(O-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N′,N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate)和HBTU(O-Benzotriazole-N,N,N′,N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate)無法偶聯(lián)，只有在BOP或者EDC體系中才能得到。另外，由于EO-OPE(NH2)是從Boc保護的EO-OPE前體得到，直接采用反應產(chǎn)物EO-OPE(NH2)·HCOOH與多肽偶聯(lián)反應，質(zhì)譜結(jié)果顯示，得到EO-OPE(NH2)與羧酸的酯化產(chǎn)物，多肽原料不參與反應，即使加入過量的DIPA中和羧酸也不能改變產(chǎn)物。因此，只能在裸露的氨基端與多肽進行偶聯(lián)。

3.2OPE-RM26放射性標記

3.2.1確定淋洗劑

在I-131標記的對照實驗中，Na131I溶液和Iodogen氧化的Na131I溶液確認氧化前后I-及其氧化產(chǎn)物的Rf值，通過與多肽反應體系對比確認標記多肽的Rf值；同時，采用C-18柱分離不同相對分子質(zhì)量的標記物進行確認(測量水洗和乙醇淋洗后得到洗液的放射性活度)。結(jié)果表明，碘化鈉和氧化后的碘容易用PBS緩沖溶液淋洗，多肽只能部分被乙醇淋洗，用其他溶劑，如乙腈、二氯甲烷、甲醇等進行淋洗，效果并不明顯，考慮到乙腈和二氯甲烷等會產(chǎn)生細胞毒性，最終采用乙醇淋洗劑。各相中的放射性滯留列于表1，由表1可知，(Tyr)3-RM26-131I和OPE-RM26-131I的溶解度較低，采用C-18柱進行分離時都發(fā)生了拖尾顯像，2 mL乙醇沖洗的條件下，只有少部分的標記物被淋洗下來。

3.2.2優(yōu)化標記條件

在OPE-RM26和(Tyr)3-RM26的標記實驗中，考察pH、反應時間、溫度、多肽的用量對標記率的影響。pH變化對標記率的影響變化曲線示于圖3，由圖3可知pH變化對多肽分子標記率的影響較??；其他標記條件反應時間、溫度、多肽用量對反應的標記率幾乎沒有影響。最終實驗結(jié)果表明，OPE-RM26和(Tyr)3-RM26在10 min、pH=7.4、20 ℃、多肽量50 μg進行標記，標記率大于90%。

3.2.3標記率及放化純度

I-131標記化合物的Whatman紙薄層色譜圖示于圖4。丙酮作展開劑相時，Na131I原液出峰時間為0.95 min(圖4a)；當還原劑Iodogen存在時，在0.35 min的位置出現(xiàn)新峰，為被還原的131I，在0.95 min仍有大量的Na131I殘留(圖4b)；(Tyr)3-RM26標記物的出峰時間為0.35 min，標記率約為95%(圖4c)；OPE-RM26標記物的出峰時間為1.15 min，標記率約95%(圖4d)，OPE-RM26溶解度較小導致其出峰時間較晚。

圖3　pH對(Tyr)3-RM26標記率的影響Fig.3　(Tyr)3-RM26 labeling ratio curve with pH

a—Na131I；b—Oxidized Na131I；c—(Tyr)3-RM26-131I; d—OPE-RM26-131I圖4　I-131標記化合物的Whatman紙薄層色譜圖a—Na131I；b—Oxidized Na131I；c—(Tyr)3-RM26-131I; d—OPE-RM26-131I Fig.4　Thin layer chromatograms of I-131 labeled compounds

標記過程中，由于加入多肽的量遠大于Na131I的量，導致產(chǎn)物的放化純度較低，嘗試采用HPLC進行純化，但標記物濃度太低且標記后產(chǎn)物與原料極性相似，很難完全分離。

3.3標記物穩(wěn)定性

通過C-18柱進行分離測量各組分的放射性活度，計算24 h后標記化合物的放化純度，考察標記物穩(wěn)定性，結(jié)果列于表2。

表2　標記物穩(wěn)定性(n=3)Table 2　Stability of labeled compounds (n=3)

由表2可知，與剛標記完的OPE-RM26分子比較，24 h后其放化純度沒有明顯下降(90%以上)。表明合成的I-131標記OPE-多肽類分子具有良好的體外穩(wěn)定性，為后續(xù)的生物細胞實驗及動物體內(nèi)實驗奠定了良好的基礎(chǔ)。

3　小結(jié)

將OPE分子與多肽拮抗劑RM26偶聯(lián)合成OPE-RM26，結(jié)果顯示，以EDC或BOP作為偶聯(lián)劑可制備OPE-RM26，產(chǎn)率為72%。采用Iodogen涂管法對OPE-RM26偶聯(lián)物進行I-131標記，標記產(chǎn)物20 ℃放置24 h，放化純度仍大于90%。本研究為制備具有靶點識別、膜穿透性、射線殺傷的多功能放射性藥物奠定基礎(chǔ)。

致謝：感謝西南醫(yī)科大學核醫(yī)學科提供的實驗場所和儀器設備。

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收稿日期：2016-03-31;修回日期：2016-06-02

基金項目：國家自然科學基金項目(21571164)

作者簡介：蹇源(1971—)，四川眉山人，研究員，主要從事同位素制備與應用、放射性藥物研究 通信作者：劉寧，教授，E-mail: nliu720@scu.edu.cn

中圖分類號：TL92+3

文獻標志碼：A

文章編號：1000-7512(2016)03-0158-06

doi：10.7538/tws.2016.29.03.0158

Coupling Reaction of Oligop-Phenylene Ethynylene and Peptide Antagonist RM26 Labeling with131I

JIAN Yuan1,2, ZHOU Zhi-jun2, ZHUO Lian-gang2, ZHAO Peng2, LIAO Wei2,WANG Guan-quan2, LIU Ning1

(1.InstituteofNuclearScienceandTechnology,KeyLaboratoryofRadiationPhysicsandTechnology

(SichuanUniversity),MinistryofEducation,SichuanUniversity,Chengdu610064,China;2.InstituteofNuclearPhysicsandChemistry,

ChinaAcademyofEngineeringPhysics,Mianyang621900,China)

Abstract:Investigations reveale that oligo p-phenylene ethynylene (OPE) molecule can insert into cell membrane, which leads to its cellular internization capacility. Antagonists have high cancer cell affinity, high uptake in cancer cells and fast clearance in normal tissue, these capabilities have attracted much research interest in radiopharmaceutical development. Combining the strong cell-penetrating ability and high affinity of Gastrin-releasing peptide which is overexpressed in the PC-3 cells, the thesis designed and synthesized unsymmetric OPE(NH2) molecule. Then the OPE(NH2) molecule was followed by the coupling reaction with RM26 peptide to obtain the OPE-RM26, and (Tyr)3-RM26 was also got for controling study. After that, the (Tyr)3-RM26 and OPE-RM26 were radiolabeled with I-131 to give high radiolabeling yields that could up to 95%. The radiolabeling compound was stable after 24 h storage at room temperature. These labeled compounds are ready for animal in-vivo experiment. It is expected that OPE-RM26-131I has multi-properties with targeting membrane crossing fire of radioactive elements. The molecule may fast travel to the target tissue and bind to GRP receptor and internalized into cancer cells. The casade process will give rise to its cancer cell toxicity due to longer retention and more killing effect of ray’s irradiation to cancer cells. In this way, OPE-RM26-131I can achieve better anti-cancer ability.

Key words：oligo p-phenylene ethynylene; peptide antagonist; coupling reaction; I-131 labeling