李　杰,　張　陳,　張　維,　周正富

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

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基于β-半乳糖苷酶為報(bào)告基因的耐輻射異常球菌啟動(dòng)子檢測(cè)載體構(gòu)建

李杰,張陳,張維,周正富*

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

耐輻射異常球菌是一種超強(qiáng)電離輻射抗性的微生物, 其含有大量的脅迫反應(yīng)相關(guān)蛋白及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,在適應(yīng)環(huán)境變化和各種脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。為深入分析該菌的抗逆基因在不同脅迫下的功能，以β-半乳糖苷酶為報(bào)告基因構(gòu)建了耐輻射異常球菌啟動(dòng)子檢測(cè)體系。以耐輻射異常球菌基因組為模板擴(kuò)增groEL、hsp20、relA和relQ啟動(dòng)子片段，將其連接到到大腸桿菌-耐輻射異常球菌穿梭載體pRADZ1上, 構(gòu)建成具有啟動(dòng)子活性檢測(cè)功能的重組質(zhì)粒pRADZ-PgroE、pRADZ-Phsp20、pRADZ-PrelA和pRADZ-PrelQ，并將其轉(zhuǎn)化至耐輻射異常球菌，測(cè)定β-半乳糖苷酶酶活。結(jié)果顯示，這些啟動(dòng)子能在耐輻射異常球菌中啟動(dòng)Lac-Z報(bào)告基因的表達(dá)，并受到脅迫條件的誘導(dǎo)調(diào)控。耐輻射異常球菌啟動(dòng)子活性檢測(cè)方法構(gòu)建為該菌株特異性脅迫應(yīng)答系統(tǒng)的研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

β-半乳糖苷酶；啟動(dòng)子活性檢測(cè)；耐輻射異常球菌；穿梭質(zhì)粒pRADZ1

耐輻射異常球菌(Deinococcusradiodurans)具有超強(qiáng)的輻射、氧化[1]、高溫、干旱等抗性[2]，被譽(yù)為“世界上最頑強(qiáng)的細(xì)菌”，極具研究和應(yīng)用價(jià)值。1999年，美國(guó)科學(xué)家完成了該菌的全基因組測(cè)序工作，并發(fā)表于《科學(xué)》雜志上。其基因組中共包含 3 187個(gè)開放閱讀框，其中僅1 493 個(gè)基因具有功能預(yù)測(cè)注釋，超過(guò)半數(shù)的預(yù)測(cè)開放閱讀框編碼未知功能的蛋白[3]。這些蛋白可能在耐輻射異常球菌適應(yīng)環(huán)境變化和各種脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著重要功能，亟需對(duì)這些蛋白的功能及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)開展深入的研究。

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase),全稱為β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶, 能水解乳糖為半乳糖和葡萄糖, 也具有轉(zhuǎn)移半乳糖苷的作用，廣泛應(yīng)用于食品加工以及醫(yī)藥、免疫、環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域[4]。β-半乳糖苷酶基因是動(dòng)物和微生物基因工程中最常用、最成熟的一種報(bào)告基因。報(bào)告基因是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白或酶的基因，其表型應(yīng)易于檢測(cè)且易于與內(nèi)源性背景蛋白相區(qū)別，利用其表達(dá)產(chǎn)物來(lái)標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控。β-半乳糖苷酶基因作為報(bào)告基因的應(yīng)用主要有以下幾方面：①用于研究啟動(dòng)子的效能和啟動(dòng)子不同位點(diǎn)突變對(duì)表達(dá)效能的影響[5]；②用于研究表達(dá)系統(tǒng)中增強(qiáng)序列等調(diào)控序列的功能；③用于衡量載體的表達(dá)特征和外源物質(zhì)對(duì)表達(dá)調(diào)控的影響[6]；④以融合基因的形式研究外源基因的表達(dá)及其規(guī)律[7,8]。

本文選取耐輻射異常球菌中重要抗逆基因groEL、hsp20、relA和relQ的啟動(dòng)子，將其克隆于大腸桿菌-耐輻射異常球菌穿梭載體pRADZ1上，構(gòu)建大腸桿菌-耐輻射異常球菌雙宿主啟動(dòng)子功能檢測(cè)質(zhì)粒pRADZ-PgroEL、pRADZ-Phsp20、pRADZ-PrelA和pRADZ-PrelQ，將其轉(zhuǎn)入耐輻射異常球菌中，通過(guò)測(cè)定β-半乳糖苷酶活性對(duì)構(gòu)建的啟動(dòng)子檢測(cè)體系進(jìn)行效能驗(yàn)證，以期獲得較為高效的耐輻射異常球菌啟動(dòng)子檢測(cè)體系。

1　材料與方法

1.1菌株和質(zhì)粒

本實(shí)驗(yàn)所采用的菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1。

1.2培養(yǎng)基與試劑

1.2.1培養(yǎng)基TGY培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、葡萄糖1 g/L(配置固體培養(yǎng)基，需額外加入瓊脂15 g/L)。高溫(112℃)高壓蒸汽滅菌30 min。

LB培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10g/L(配置固體培養(yǎng)基，需額外加入瓊脂15 g/L)。高溫(121℃)高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2.2試劑碳酸鈉終止液(1 mol/L)：稱取106 g的碳酸鈉，溶解于1 L的蒸餾水中，調(diào)整pH至7.5，室溫保存。

鄰硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)：將ONPG固體溶于0.1 mol/L pH 7.5的磷酸鈉緩沖液中，終濃度為4 mg/mL，4℃保存。

Z Buffer：分別稱取16.1 g Na2HPO4·7H2O固體、4.78 g NaH2PO4固體、0.75 g KCl固體和0.246 g MgSO4·7H2O固體，加蒸餾水溶解，定容至1 L，調(diào)整pH至7.0，使用前加β-巰基乙醇。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1DNA 的提取及操作質(zhì)?？焖偬崛　z測(cè)以及DNA 的酶切、連接、大腸桿菌感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化按《分子克隆》[9]所述方法進(jìn)行，耐輻射異常球菌的轉(zhuǎn)化參照Spizizen[10]提供的方法進(jìn)行。

1.3.2載體構(gòu)建根據(jù)耐輻射異常球菌基因組序列，設(shè)計(jì)引物(表2)。以D.radioruans的基因組為模板，分別擴(kuò)增groEL、hsp20、relA和relQ基因的啟動(dòng)子片段。擴(kuò)增體系(20.0 μL)：10×PCR緩沖液2 μL，dNTPs混合溶液2 μL，10 μmol/L引物0.5 μL，Taq酶0.2 μL，25 mg/L DNA模板2.0 μL。PCR獲得了耐輻射異常球菌分子伴侶蛋白基因groEL、熱激蛋白基因hsp20、嚴(yán)緊反應(yīng)關(guān)鍵酶基因relA和relQ基因的啟動(dòng)子片段，片段大小分別為463 bp、248 bp、313 bp和282 bp。連接克隆載體pJET1.2/blunt vector，轉(zhuǎn)化到E.coliJM109感受態(tài)中，涂布于含有 50 μg/mL Amp的LB固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆。利用BglⅡ和SpeⅠ酶切載體pRADZ1和重組子pJET-PgroEL、pJET-Phsp20、pJET-PrelA、pJET-PrelQ，切膠回收酶切產(chǎn)物，連接得到載體pRADZ-PgroEL、pRADZ-Phsp20、pRADZ-PrelA和pRADZ-PrelQ(圖1，彩圖見(jiàn)圖版一)。篩選合適的重組子，酶切及測(cè)序驗(yàn)證。

表2　引物列表

注：劃線部分為酶切位點(diǎn)。

1.3.3線性轉(zhuǎn)化活化甘油管里的D.radioruans菌株并轉(zhuǎn)接于新鮮TGY液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)至OD600=0.6時(shí)，收集菌體。菌體中加入180 μL TGY液體培養(yǎng)基、20 μL 70%的甘油、20 μL 0.3 mol/L CaCl2，劇烈震蕩重懸菌體，30℃溫水浴孵育80 min。取出50 μL菌液于新管中，加入要轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒10 μL，充分震蕩混勻，30℃溫水浴孵育90 min。加入新鮮TGY培養(yǎng)基，30℃搖床培養(yǎng)12 h。菌液涂布于含有3 μg/mL氯霉素的TGY固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d，篩選重組子。

1.3.4β-半乳糖苷酶測(cè)定方法接種重組菌株到含有3 μg/mL氯霉素的TGY液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)種子液。按初始OD600=0.1轉(zhuǎn)接至50 mL培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)至OD600=0.6。取出菌液1 mL，離心收集菌體，重懸于500 μL Z buffer中，加入50 mmol/L β-巰基乙醇、50 μg/mL溶菌酶、10 μg/mL DNase1，震蕩混勻，37℃孵育1 h，加20 μL甲苯。37℃孵育120 min，加入150 μL鄰硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)，混勻后30℃孵育直至出現(xiàn)黃色，記錄反應(yīng)開始時(shí)間。待樣品出現(xiàn)黃色，再加入500 μL 1 mol/L的Na2CO3終止反應(yīng)，記錄反應(yīng)終止時(shí)間，樣品放冰上待測(cè)。將樣品在4℃，12 000 g離心10 min，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定上清OD550和 OD420值，作為對(duì)照。

圖1　重組載體pRADZ-PgroEL構(gòu)建示意圖Fig.1　The construction of vector pRADZ-PgroEL.(彩圖見(jiàn)圖版一)

熱激脅迫樣品處理?xiàng)l件：菌株培養(yǎng)至OD600=0.6時(shí)，轉(zhuǎn)移到42℃搖床熱激處理2 h，收集菌體測(cè)定酶活，處理過(guò)程與對(duì)照組相同。

按以下公式計(jì)算β-半乳糖苷酶的活性：

U=1 000×(OD420-1.75×OD550)/(t×0.1×OD600)

其中t為反應(yīng)時(shí)間(min)。

1.3.5熒光實(shí)時(shí)定量PCR本研究使用SYBR?Premix ExTaqTM試劑盒配置實(shí)時(shí)定量q-PCR反應(yīng)體系，用 7500型實(shí)時(shí)定量?jī)x進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品平行3次。 使用相對(duì)定量方法，以野生型菌株D.radiodurans的16S rDNA作為內(nèi)部參比基因，利用ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1耐輻射異常球菌啟動(dòng)子檢測(cè)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

利用本實(shí)驗(yàn)室保存的含有β-半乳糖苷酶報(bào)告基因的大腸桿菌-耐輻射異常球菌穿梭載體pRADZ1作為基礎(chǔ)載體，并對(duì)其改造。將獲得的啟動(dòng)子片段插入到載體β-半乳糖苷酶報(bào)告基因上游，完成耐輻射異常球菌啟動(dòng)子檢測(cè)載體的構(gòu)建,并通過(guò)雙酶切以及測(cè)序驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子(圖2)。將篩選正確的重組質(zhì)粒pRADZ-PgroEL、pRADZ-Phsp20、 pRADZ-PrelA和pRADZ-PrelQ轉(zhuǎn)入耐輻射異常球菌野生型菌株中，利用抗性篩選獲得正確重組菌株。

圖2　重組質(zhì)粒BglⅡ/SpeⅠ酶切電泳Fig.2　Digestion results of recombinant plasmid by BglⅡ/SpeⅠ.M:Trans2K Plus Ⅱ DNA maker; 1.pRADZ-PrelA; 2:pRADZ-PrelQ; 3:pRADZ-Phsp20; 4:pRADZ-PgroEL

2.2啟動(dòng)子檢測(cè)載體β-半乳糖苷酶活性測(cè)定

重組菌株β-半乳糖苷酶活性測(cè)定結(jié)果(圖3)顯示，正常條件下，relA的酶活是64.41，而42℃熱激2 h后，酶活為139.36，上調(diào)了2.12倍。relQ在正常條件下酶活為65.83，熱激后酶活為132.01，上調(diào)了2倍。hsp20在正常條件下酶活為11 049.75，而熱激后，酶活為45 131.00，上調(diào)了4.08倍。與正常條件下相比，熱激后groEL酶活從2 316.81提高為5 432.80，上調(diào)了2.34倍。

圖3　耐輻射異常球菌啟動(dòng)子β-半乳糖苷酶活性測(cè)定Fig.3　Promoter activities in D. radiodurans using lacZ reporter gene.A：正常條件和42℃熱激處理下relA、relQ啟動(dòng)子β-半乳糖苷酶測(cè)定；B：正常條件和42℃熱激處理下hsp20啟動(dòng)子β-半乳糖苷酶測(cè)定；C：正常條件和42℃熱激處理下groEL啟動(dòng)子β-半乳糖苷酶測(cè)定

2.3啟動(dòng)子檢測(cè)體系的實(shí)時(shí)定量q-PCR驗(yàn)證

利用實(shí)時(shí)定量q-PCR對(duì)耐輻射異常球菌的分子伴侶蛋白GroEL、熱激蛋白Hsp20、嚴(yán)緊反應(yīng)關(guān)鍵酶RelA和RelQ在正常生長(zhǎng)與42℃熱激條件下的表達(dá)量進(jìn)行分析，對(duì)構(gòu)建啟動(dòng)子檢測(cè)體系的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。研究結(jié)果顯示(圖4)，熱激條件下groEL與hsp20表達(dá)發(fā)生顯著變化，分別上調(diào)了3.97倍和6.95倍；relA與relQ的表達(dá)也同樣提高，分別提高了1.91倍和2.12倍。實(shí)時(shí)定量q-PCR驗(yàn)證結(jié)果與β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)結(jié)果基本一致。

圖4　熱激脅迫下抗逆相關(guān)基因groEL、hsp20、relA和relQ的相對(duì)表達(dá)量Fig.4　The expression of groEL, hsp20, relA and relQ of D. radiodurans under different conditions.

3　討論

耐輻射異常球菌中，groEL基因編碼分子伴侶蛋白，在某一蛋白質(zhì)不能自發(fā)折疊的情況下，GroEL與輔分子伴侶GroES能促進(jìn)蛋白質(zhì)的折疊, GroEL具有ATP水解酶的活性部位，可結(jié)合并水解ATP，同時(shí)自身構(gòu)象發(fā)生改變[11]。groEL啟動(dòng)子在42℃熱激2 h后β-半乳糖苷酶酶活顯著提高，為正常條件下的2.34倍。RelA是核糖體結(jié)合蛋白，可催化ATP 的焦磷酸根基團(tuán)轉(zhuǎn)移到GTP或GDP核糖的3′羥基合成pppGpp或ppGpp[12]。在革蘭氏陰性菌中，RelA僅具有(p)ppGpp合成酶活性，而在陽(yáng)性菌中RelA具有(p)ppGpp合成酶和水解酶活性。RelQ首先發(fā)現(xiàn)于變形鏈球菌中，是一種短的(p)ppGpp合成酶，且僅具有(p)ppGpp合成酶活性[13]。42℃熱激2 h后，relA和relQ的β-半乳糖苷酶酶活約為正常條件下的2倍。Hsp20是小的熱休克蛋白，它能提高菌對(duì)過(guò)氧化氫的耐受性，激活氧化還原狀態(tài)的蛋白，從而保持氧化還原平衡[14]。熱激后hsp20的β-半乳糖苷酶酶活約為正常條件下的4倍，與Singh等[13]的結(jié)果一致。

β-半乳糖苷酶為報(bào)告基因的啟動(dòng)子檢測(cè)結(jié)果與實(shí)時(shí)定量q-PCR檢測(cè)結(jié)果都能夠有效的表明不同條件下基因的表達(dá)變化。相比之下，實(shí)時(shí)定量q-PCR僅能反應(yīng)基因在不同樣本間的相對(duì)變化關(guān)系，但β-半乳糖苷酶啟動(dòng)子檢測(cè)結(jié)果不僅能夠反應(yīng)這種變化趨勢(shì),還能夠很好地展現(xiàn)基因在整個(gè)細(xì)胞代謝中的相對(duì)表達(dá)量。本研究中，分子伴侶蛋白基因groEL、熱激蛋白基因hsp20在熱激條件下的表達(dá)量都發(fā)生上調(diào)。實(shí)時(shí)定量q-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示這2個(gè)基因都發(fā)生了顯著的變化，但2個(gè)基因之間是無(wú)法比較的。β-半乳糖苷酶啟動(dòng)子檢測(cè)結(jié)果顯示groEL基因的表達(dá)量在2 316.81～5 432.80單位范圍變化，而hsp20從11 049.75提高到45 131.00個(gè)單位。這樣的結(jié)果表明，hsp20在細(xì)胞應(yīng)對(duì)熱激脅迫條件中變化更為劇烈，可能發(fā)揮更加重要的生理功能。β-半乳糖苷酶具有蛋白折疊簡(jiǎn)單、定量檢測(cè)方便和檢測(cè)靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，有利于基因啟動(dòng)子及調(diào)控序列的研究。本文在大腸桿菌-耐輻射異常球菌穿梭載體pRADZ1基礎(chǔ)上構(gòu)建了以β-半乳糖苷酶為報(bào)告基因的耐輻射異常球菌啟動(dòng)子檢測(cè)體系。通過(guò)測(cè)定β-半乳糖苷酶活性，對(duì)該菌重要抗逆基因groEL、hsp20、relA和relQ的啟動(dòng)子功能展開分析，并利用實(shí)時(shí)定量q-PCR對(duì)構(gòu)建的啟動(dòng)子檢測(cè)體系進(jìn)行效能驗(yàn)證，獲得了較為高效的耐輻射異常球菌啟動(dòng)子檢測(cè)方法。

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Construction of Promoter Function Analysis Vector Using β-galactosidase Report System inDeinococcusradiodurans

LI Jie, ZHANG Chen, ZHANG Wei, ZHOU Zheng-fu*

BiotechnologyResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China

Deinococcusradioduransis a robust bacterium which shows extreme ionizing-radiation tolerance. Abundant proteins and transcriptional factors are important for the various stress response inD.radiodurans. In order to construct the promoter function analysis system that use β-galactosidase gene as report gene inD.radiodurans, we used the genome ofD.radioduransas template to amplificate the promoters ofgroEL,hsp20,relAandrelQby PCR, then connected them toE.coli-D.radioduransshuttle vector pRADZ1, obtained the recombinant plasmids pRADZ-PgroEL, pRADZ-Phsp20, pRADZ-PrelAand pRADZ-PrelQ, which could analyze the activity of promoter. Then we transformed those recombinant plasmids intoD.radiodurans, and measured the activity of β-galactosidase, the result showed that these promoters can start expression ofLac-Z, and could be regulated under stress. This study provided theoretical basis for the further work of stress response mechanism inDeinococcusradiodurans.

β-galactosidase; promoter function analysis;Deinococousradiodurans; shuttle vector

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.04.08

2016-03-03; 接受日期：2016-04-08

國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目(2015CB755700);國(guó)家轉(zhuǎn)基因新品種培育重大專項(xiàng)(2014ZX0800301B);國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31370126)資助。

李杰，本科生，研究方向抗逆微生物分子生物學(xué)。*通信作者：周正富，助理研究員，博士，主要從事極端環(huán)境微生物分子生物學(xué)研究。E-mail：zhouzhengfu@caas.cn