呂若蕓,　王　輝,　陳　忱,　張世雄,　張曉楠,　曹晨華,　魏敬雙

華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司, 抗體藥物研制國家重點實驗室, 石家莊 050015

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N-糖鏈切除對重組抗狂犬病毒單克隆抗體中和活性的影響

呂若蕓§,王輝§,陳忱,張世雄,張曉楠,曹晨華,魏敬雙*

華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司, 抗體藥物研制國家重點實驗室, 石家莊 050015

重組抗狂犬病毒單克隆抗體是一種全人源的抗病毒感染單抗，主要用于狂犬病毒暴露后預(yù)防。采用糖苷酶處理2種重組抗狂犬病毒單克隆抗體Mab1、Mab2水解切除N-糖鏈，通過糖染色和毛細管電泳檢測確定N-糖鏈酶解程度，利用快速熒光灶抑制試驗檢測其中和活性，分析N-糖鏈切除對該單抗中和活性的影響。結(jié)果顯示，N-糖鏈切除后抗體中和活性無明顯變化。說明N-糖鏈對這兩株抗狂犬病毒單抗的體外中和活性不是必須的結(jié)構(gòu)成分。

重組抗狂犬病毒單克隆抗體；N-糖鏈切除；毛細管電泳；中和活性

重組單克隆抗體是通過蛋白質(zhì)突變和修飾而形成的復雜混合異構(gòu)物，其結(jié)構(gòu)和功能復雜。在對抗體糖基化的研究中人們發(fā)現(xiàn)， N糖基化是其最常見、復雜的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一。通常IgG的每個重鏈Fc區(qū)靠近鉸鏈處的CH2結(jié)構(gòu)域均有一個N-連接的糖基化位點(Asn297)，該位點十分保守[1,2]，其可通過單價鏈接形成雙角N-糖鏈。在CH2區(qū)N-糖鏈協(xié)助維持一種開放的馬蹄形構(gòu)象，有利于促進與Fcγ受體的互作[3]。研究表明糖鏈在維持重組單克隆抗體的正常結(jié)構(gòu)、功能以及其生物學特性(識別抗原觸發(fā)免疫系統(tǒng)細胞、調(diào)節(jié)信號活性等)和物理化學性質(zhì)(溶解度、蛋白質(zhì)折疊等)中發(fā)揮著重要作用，不同糖型對其功能和活性的影響不完全相同[4～6]；抗體的N-糖基化與Fc區(qū)功能相關(guān)，可影響抗體Fc部分的結(jié)構(gòu)特點、免疫原性(尤其是1,3-α-Gal糖類)、藥代動力學、分布、溶解度以及抗體穩(wěn)定性，從而可潛在調(diào)節(jié)抗體的效應(yīng)功能和藥物動力學，刪除糖鏈可導致抗體構(gòu)象改變，降低或消除與Fcγ受體的結(jié)合[1,2]。此外還有研究表明改造抗體 Fc 段的糖鏈，其某些生物學功能可發(fā)生顯著改變[7,8]，目前已有通過糖基化改造的治療性抗體藥物進入臨床試驗階段[9]。因此，控制重組單克隆抗體的N-糖基化從而優(yōu)化其效應(yīng)功能代表一種重要的研究領(lǐng)域。在自體免疫疾病、病毒感染、慢性炎癥和癌癥中應(yīng)注重對IgG N-糖基化作用機制的研究，并闡明其分子病理學機制。

本研究中的2種重組抗狂犬病毒單克隆抗體均為全人源的IgG1亞型抗感染病毒的單抗，由CHO細胞表達，主要用于狂犬病毒暴露后預(yù)防。重組抗狂犬病毒單克隆抗體具有典型的IgG1亞型N-糖鏈結(jié)構(gòu)，即在CH2 結(jié)構(gòu)域有雙觸角復雜型的巖藻糖化的N-糖鏈[10,11]，N-糖鏈包埋在其中，形成特殊的作用形式[12]。本研究使用糖苷酶水解切除重組單克隆抗體的N-糖鏈，通過糖蛋白染色和毛細管電泳(CE-SDS)檢測兩種方法確定N-糖鏈酶解程度，利用快速熒光灶抑制試驗法(rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT)檢測其中和活性，研究N-糖鏈對2種重組抗狂犬病毒單克隆抗體中和活性的影響，以期為其N-糖鏈的質(zhì)量控制和抗狂犬病毒抗體的研發(fā)提供參考。

1　材料與方法

1.1供試品

由CHO細胞表達的重組抗狂犬病毒單抗Mab1、重組抗狂犬病毒單抗Mab2樣品為本實驗室制備，蛋白質(zhì)含量均為5 mg/mL。

1.2試劑及儀器

試劑：超純水(Milli-Q)、碳酸氫銨(分析純)、高碘酸(分析純)、乙酸(分析純)、乙醇(分析純)、希夫試劑(分析純)、偏重亞硫酸鈉(分析純)、鹽酸(分析純)、糖苷酶N-Glycanase (Prozyme,GKE-5006B)、電泳緩沖液(ABsciex公司)、β-巰基乙醇、1640RPMI培養(yǎng)基(Hyclone)、胎牛血清(蘭州民海生物工程有限公司)、狂犬病毒標準攻擊毒株CVS(武漢生物制品研究所)、抗狂犬病毒N蛋白熒光抗體(Fujirebio.Dia.Inc)、WHO抗狂犬病毒抗體活性標準品、BSR細胞(武漢生物制品研究所)。

儀器：毛細管電泳儀PA800 Plus(ABsciex公司);紫外檢測器(ABsciex公司);毛細管:無涂層毛細管(Beckman,338451)，內(nèi)徑50 μm,安裝至毛細管卡盒中使其總長31 cm，有效長度為20 cm(進口到檢測窗之間的長度)，檢測窗為8(100 μm×800 μm);熒光顯微鏡。

1.3試驗方法

1.3.1糖鏈切除糖苷酶的水解樣品制備將2種單抗樣品Mab1、Mab2分別用除菌純水稀釋至1 mg/mL，分別取150 μL樣品向其中加入6 μL糖苷酶，37℃水浴3 h，4℃放置備用。同時再分別取150 μL濃度為1 mg/mL的單抗樣品，不加糖苷酶37℃水浴3 h，4℃放置備用作為對照。

1.3.2聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳凝膠采用4.5%濃縮膠，12.5%分離膠。未經(jīng)任何處理的Mab1、Mab2原液樣品和經(jīng)水浴酶解的樣品以及經(jīng)水浴未酶解的樣品與4×還原樣品緩沖液混合均勻，70℃水浴3 min后10 000 r/min離心1 min。上樣量為10 μg，恒流電泳，濃縮膠電流為10 mA，待指示劑進入分離膠后調(diào)整電流至20 mA，指示劑距凝膠底部0.5 cm時停止電泳。

1.3.3糖蛋白染色電泳結(jié)束后將電泳膠放入50%乙醇中固定2 h；再放入1%高碘酸，3%乙酸溶液搖洗15 min氧化；3%乙酸-水溶液搖洗2次，每次10 min；希夫試劑避光搖洗45 min染色；0.1%偏重亞硫酸鈉，10 mmol/L鹽酸搖洗30 min顯色。

1.3.4考馬斯亮藍染液復染將經(jīng)糖蛋白染色后的電泳凝膠放入考馬斯亮藍染色液室溫振蕩染色1～2 h，染色完成后用蒸餾水漂洗凝膠去除殘留的染色液，再加入脫色液脫色至凝膠背景透明后用掃描儀掃描記錄，凝膠用保存液保存。

1.3.5毛細管電泳(CE-SDS)將抗體原液樣品、糖苷酶水解抗體樣品、水浴處理抗體對照樣品50 μL與50 μL CE-SDS樣品緩沖液混勻，向其中加入5 μL β-巰基乙醇，70℃水浴15 min，室溫水浴5 min，10 000 r/min離心1 min。轉(zhuǎn)移75 μL樣品至毛細管電泳儀樣品管中，進行還原CE-SDS分析。電泳條件:毛細管溫度為18℃，在-10 kV電壓條件下進樣30 s，然后在-15 kV電壓下以分離膠為電泳緩沖液分離40 min，檢測波長214 nm。

1.3.6中和活性檢測采用快速熒光灶抑制試驗法(RFFIT)檢測抗體原液樣品、經(jīng)糖苷酶水解的抗體樣品和水浴處理的抗體對照樣品的抗狂犬病病毒的中和活性。將待檢樣品和標準品3倍系列稀釋后與狂犬病病毒標準攻擊毒株 CVS 混合，同時設(shè)正常對照孔和中和用病毒對照孔，混勻后置37℃中和1 h；再加入BSR細胞懸液，5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)24 h；待培養(yǎng)結(jié)束吸干培養(yǎng)液，加入PBS清洗并吸干后，再加入預(yù)冷至4℃的80%丙酮固定細胞30 min，棄丙酮；最后待揮發(fā)干燥后加入抗狂犬病病毒N蛋白熒光標記抗體標記熒光灶，37℃孵育30 min，棄去液體，并用PBS洗板、甩干，每孔加入80%甘油50 μL，在熒光顯微鏡下觀察，比較待檢樣品和標準品的ED50并按以下公式計算待測樣品的效價。

式中E為低于50%熒光灶比例的標準品/供試品稀釋度；F為供試品低于50%熒光灶比例孔的熒光灶百分比；G為供試品高于 50%熒光灶比例孔的熒光灶百分比；n2為供試品稀釋倍數(shù)。

供試品效價(IU/mL)=10(J-K)×L

式中J為標準品lgED50；K為供試品lgED50；L為標準品的效價(IU/mL )。

2　結(jié)果與分析

2.1重組抗狂犬病毒單克隆抗體的糖染、復染結(jié)果

為檢測糖苷酶切除糖鏈條件是否可切除2種重組抗狂犬病毒單克隆抗體的糖鏈，對抗體原液樣品、糖苷酶水解抗體樣品和水浴處理抗體對照樣品進行SDS-PAGE，并進行糖染色和考馬斯亮藍復染。結(jié)果(圖1,彩圖見圖版二)顯示：①在糖染色中2種抗體的抗體原液樣品和水浴處理抗體對照樣品在重鏈位置均可見明顯條帶，輕鏈位置均無明顯條帶，表明這2種抗體的糖鏈可能主要位于重鏈，輕鏈上無糖鏈。而經(jīng)糖苷酶水解的抗體樣品未見明顯條帶，表明經(jīng)酶解的樣品不再含N-糖鏈；②經(jīng)考馬斯亮藍復染后所有的樣品均可見明顯條帶，但2種抗體經(jīng)糖苷酶水解抗體樣品的重鏈位置與其他2個樣品相比重鏈位置略偏下，這可能是因為切除糖鏈后重鏈分子量下降所致。

圖1　Mab1和Mab2糖蛋白染色(A)和考馬斯亮藍染液復染(B)Fig.1　Gel staining of Mab1 and Mab2 by periodic acid-schiff method (A) and re-staining by coomassie brilliant blue(B).1：Mab1抗體樣品; 2：37℃水浴處理Mab1抗體對照樣品; 3：經(jīng)37℃糖苷酶水解的Mab1抗體樣品; 4：Mab2抗體樣品; 5：37℃水浴處理Mab2抗體對照樣品; 6：經(jīng)37℃糖苷酶水解的Mab2抗體樣品(彩圖見圖版二)

2.2重組抗狂犬病毒單克隆抗體還原CE-SDS結(jié)果

還原CE-SDS電泳可以實現(xiàn)將非糖基化重鏈與糖基化重鏈完全分離。為驗證糖苷酶切除重組抗狂犬病毒單克隆抗體糖鏈的效果，對抗體原液樣品、糖苷酶水解抗體樣品和水浴處理抗體對照樣品進行CE-SDS還原電泳。圖2、3(彩圖見圖版二)結(jié)果顯示：①Mab1抗體和Mab2抗體原液樣品和水浴處理抗體對照樣品重鏈(含量均為66.0%)出峰時間重合, 在兩者重鏈前有少量的非糖基化重鏈成分(分別為0.4%和1.3%,n≥3); ②糖苷酶水解抗體樣品可以觀察到切除糖鏈的重鏈出峰時間提前至非糖基化重鏈成分處，其含量也顯著提高(Mab1抗體和Mab2抗體分別為65.4%和65.8%,n≥3)，糖基化重鏈含量大大降低(Mab1抗體和Mab2抗體分別為0.7%和1.2%,n≥3)，表明本研究所采用的酶切方法可去除Mab1抗體和Mab2抗體中98%的糖鏈結(jié)構(gòu)，糖鏈的切除比較完全。

2.3重組抗狂犬病毒單克隆抗體RFFIT活性測定結(jié)果

對2種抗體RFFIT活性測定結(jié)果(圖4)，結(jié)果采用SPSS軟件One-way ANOVA數(shù)據(jù)分析方法分析抗體原液樣品、糖苷酶水解抗體樣品和水浴處理抗體對照樣品效價對數(shù)值均值，分析結(jié)果表明2種抗體均無顯著差異(Mab1 sig=0.73, Mab2sig=0.13,n≥3)。本實驗結(jié)果表明將糖鏈切除后2種單抗樣品的RFFIT活性未發(fā)生明顯變化。

圖2　Mab1還原CE-SDS圖譜Fig.2　The graph of reduced CE-SDS of Mab1.1.為Mab1抗體樣品還原CE-SDS圖譜;2.為經(jīng)37℃糖苷酶水解的Mab1抗體樣品還原CE-SDS圖譜;3.為37℃水浴處理Mab1抗體對照樣品還原CE-SDS圖譜。(彩圖見圖版二)

圖3　Mab2還原CE-SDS圖譜Fig.3　The graph of reduced CE-SDS of Mab2.1.為Mab2抗體樣品還原CE-SDS圖譜;2.為經(jīng)37℃糖苷酶水解的Mab2抗體樣品還原CE-SDS圖譜;3.為37℃水浴處理Mab2抗體對照樣品還原CE-SDS圖譜。(彩圖見圖版二)

3　討論

在SDS-PAGE糖蛋白染色圖譜中，可見在所選用的糖苷酶切除糖鏈的條件下基本無肉眼可見的糖蛋白條帶，表明絕大部分糖鏈已被切除。但糖蛋白染色法的靈敏度較低不能保證所有糖鏈均被切除，為避免其影響后續(xù)試驗對結(jié)果的判斷，采用毛細管電泳法對糖鏈切除的結(jié)果進行了驗證，結(jié)果表明糖鏈已切除完全。目前抗體N-糖鏈分析的常用方法有毛細管電泳(CELIF)、質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)、親水相互作用色譜(HILIC-HPLC/UPLC)以及核磁共振法(NMR) 等，這些方法均具有良好的分離度、準確性和精密性，并各有優(yōu)勢。由于不同抗體N-糖鏈分析方法的樣品處理過程和分離機理存在一些差異，使其在部分糖型的檢測中存在差異[13]。毛細管電泳具有高效、快速、分離度高、靈敏度高、分離模式多樣性以及操作相對簡便等特點，能夠在幾十分鐘內(nèi)完成對單抗N-糖鏈的檢測。因此在抗體N-糖鏈分析的檢驗中，CELIF基于產(chǎn)品明確的表征信息，可用于單抗N-糖鏈進行合理控制[13]。

圖4　RFFIT活性測定結(jié)果Fig.4　The bioactivity results by RFFIT.注：E為樣品效價測定值(IU/mL)；lgE為效價的對數(shù)值；Mean lgE為效價對數(shù)值的平均值。

本研究中的重組單抗Mab1和Mab2是針對狂犬病毒開發(fā)的全人源抗狂犬病毒單抗。Mab1和Mab2切除N-糖鏈后抗體的中和活性未發(fā)生明顯下降。其原因可能是：在抗體的空間結(jié)構(gòu)上，抗狂犬病毒抗體的中和作用機制主要是通過抗體的Fab可變區(qū)與狂犬病毒表面的G蛋白進行識別[14～16]，負責與抗原特異性結(jié)合;而其N-糖鏈位于CH2區(qū)，抗體N-糖鏈的修飾似乎可誘導CH2區(qū)發(fā)生結(jié)構(gòu)性改變，同時兩者在空間上有一定距離，從而導致這種改變并未延伸到抗原結(jié)合的Fab區(qū)，因此抗體N-糖鏈的切除不能明顯影響其與抗原的結(jié)合能力[17]。因此Mab1和Mab2兩種抗體的中和活性在切除糖鏈后無明顯變化，至于切除N-糖鏈對上述兩種抗體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、體內(nèi)活性、半衰期等方面是否有影響，則有待于我們進一步的研究。

此外,目前已有國內(nèi)外學者使用大腸桿菌、酵母等表達系統(tǒng)也獲得了一些抗狂犬病毒抗體或者片斷，如二硫鍵穩(wěn)定性Fv 抗體片段(disulfide-stabilized Fv fragment, dsFv)、單鏈Fv片段(single-chain Fv fragment, scFv)等，并對它們抗狂犬病毒的中和活性進行了深入的研究。趙小玲等[18]使用大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得人源抗狂犬病毒二硫鍵穩(wěn)定性Fv抗體片段(dsFv)，其對狂犬病毒的中和實驗結(jié)果顯示， dsFv可特異的中和狂犬病毒，阻止狂犬病毒對Vero 細胞的吸附，從而抑制靶細胞感染，使蝕斑減少甚至消失。Duan等[19]對人源抗狂犬病毒單抗MAB57構(gòu)建了單鏈Fv片斷FV57，為增強其穩(wěn)定性和中和潛力，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了二硫鍵穩(wěn)定化的scFv，即ds-FV57 。該片段同樣是用大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得，經(jīng)RFFIT活性檢測和小鼠狂犬病毒挑戰(zhàn)模型試驗結(jié)果證明，它除了具有體外中和活性外，還能對小鼠抵抗狂犬病毒感染提供有效的保護作用。王丁丁等[20]使用分步整合法在巴氏畢赤酵母中表達人抗狂犬病毒全分子抗體，ELISA檢測結(jié)果顯示該抗體具有良好的狂犬病毒抗原結(jié)合活性。以上研究中由大腸桿菌和酵母表達系統(tǒng)獲得的產(chǎn)物不具有糖基化或糖基化不完全，而這些分子均具有抗狂犬病毒的中和活性。因此有力的證明了在抗狂犬病毒抗體對狂犬病毒的中和作用中，N-糖鏈可能不是其發(fā)揮中和作用必需的結(jié)構(gòu)，中和作用的核心在于抗體可變區(qū)對抗原的識別和結(jié)合。也就是說，由于切除的N-糖鏈位于抗體Fc區(qū)，而中和活性應(yīng)該與抗體的Fab區(qū)關(guān)系更為密切。

同時國內(nèi)有文獻報道顯示，如果刪除糖鏈，可使靶抗原結(jié)合能力下降。陶磊等[21]對重組嵌合抗CD20 IgG1型單抗糖鏈切除對其結(jié)構(gòu)與功能的影響進行了研究，研究結(jié)果顯示切除N-糖鏈后IgG1型單抗對CD20的抗原結(jié)合能力下降，體外CDC活性基本消失，糖鏈是維持該IgG1型單抗正常結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分。而本研究使用RFFIT檢測待測品的抗狂犬病毒中和活性的研究結(jié)果則表明，N-糖鏈切除以及水浴對這兩種抗體中和活性均無明顯影響。

綜上所述，N-糖鏈對重組單抗的生物學功能的影響因抗體分子不同而機制各異，不能一概而論。尤其對于全新的單抗分子，其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系更是需要進行詳細的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系研究，才能逐步明晰抗體分子精細結(jié)構(gòu)與具體功能之間的內(nèi)在聯(lián)系。

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Effect of the N-glycan Removal on the Neutralization Activity of Recombinant Anti-rabies Monoclonal Antibodies

LV Ruo-yun§, WANG Hui§, CHEN Chen, ZHANG Shi-xiong, ZHANG Xiao-nan, CAO Chen-hua, WEI Jing-shuang*

StateKeyLaboratoryofAntibodyResearch&Development,NewDrugResearchandDevelopmentCompanyLtd.,NorthChinaPharmaceuticalCorporation,Shijiazhuang050015,China

The recombinant anti-rabies monoclonal antibody were fully-human-derived antibody and were used for post-explosure prophylaxis of rabies virus. The N-glycan of two anti-rabies monoclonal antibodies (Mab1 and Mab2) were hydrolyzed by the PNGase in this study, the capillary electrophoresis and gel staining by periodic acid-schiff method were used to determine the residual N-glycan after hydrolysis. The rapid fluorescent focus inhibition test was used to compare the neutralization bio-activity of the intact Mab1 and the Mab2 without N-glycan. The result showed that the neutralization bioactivity of Mab1 and Mab2 did not change after the N-glycan was removed from the antibodies. That suggests the N-glycan was not the indispensable composition for in-vitro neutralization bioactivity of Mab1 and Mab2.

recombinant anti-rabies virus monoclonal antibody; N-glycan removal; capillary electrophoresis; neutralization activity

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.04.10

2016-05-18; 接受日期：2016-06-12

“十二五”國家科技重大專項(2014ZX09201041)資助。

§呂若蕓與王輝為本文共同

。呂若蕓，工程師，研究方向為單抗藥物純化與質(zhì)量研究。E-mail:lvry2010@163.com。王輝，工程師，研究方向為單抗藥物純化與質(zhì)量研究。E-mail：whui@163.com。*通信作者：魏敬雙，正高級工程師，研究方向為生物技術(shù)藥物研發(fā)。E-mail:weijsh@hotmail.com