郭　翔,　阮志勇,　宋金龍,　周　珊,　王彥偉,　何明雄,　劉小秧,　胡國全*

1.農(nóng)業(yè)部沼氣科學(xué)研究所, 農(nóng)業(yè)部農(nóng)村可再生能源開發(fā)利用重點實驗室, 成都 610041;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所, 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點實驗室, 北京 100081;3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院, 北京 100141

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KurthiahuakuiiLAM0618T重組酚氧化酶LaclK對乙基紫脫色的研究

郭翔1,2,阮志勇2*,宋金龍3,周珊2,王彥偉1,何明雄1,劉小秧2,胡國全1*

1.農(nóng)業(yè)部沼氣科學(xué)研究所, 農(nóng)業(yè)部農(nóng)村可再生能源開發(fā)利用重點實驗室, 成都 610041;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所, 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點實驗室, 北京 100081;3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院, 北京 100141

乙基紫；LaclK；KurthiahuakuiiLAM0618T；酚氧化酶；脫色

染料廣泛應(yīng)用于紡織染色、紙張、化妝品、食品等行業(yè)[1]。在工業(yè)上，全世界每年使用的染料和色素有近10 000種，超過7×105t[2]。在染色過程中，有10%～15%的染料隨著廢水排放。有色工業(yè)廢水水質(zhì)成分復(fù)雜，毒性大，嚴重威脅著水生生物和人類的健康[3]。因此廢水中染料的去除或降解對生態(tài)環(huán)境和生物健康具有極其重要的意義。

染料廢水處理方法主要分為物理法、化學(xué)法和生物法3種。傳統(tǒng)的物理法和化學(xué)法有很多不足，如高成本、低效率、條件限制、其他廢水成分的干擾、形成毒性更大的副產(chǎn)物以及密集的能源需求等[4]。生物法主要是依靠微生物合成的酶，如漆酶、細胞色素P450和木質(zhì)素降解酶等[5,6]。生物法擁有高效節(jié)能、綠色環(huán)保、適應(yīng)面廣等優(yōu)勢，已成為處理染料廢水的重要方法[7]。

1　材料與方法

1.1材料

E.coliBL21(DE3)/pET28a-laclK原核表達菌株為本實驗構(gòu)建；2,6-二甲氧基苯酚購自Sigma公司；染料乙基紫和其他試劑如甲醇、乙醇、二甲基亞砜、 NaCl、NaF、NaBr、KI、NaNO3、Na2SO4、腐殖酸等均為市售分析純或色譜純。

1.2方法

1.2.1重組酶的誘導(dǎo)表達與純化E.coliBL21(DE3)/pET28a-laclK接種于液體LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)，37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)到OD600≈ 0.6，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG和0.2 mmol/L CuSO4·5H2O，16℃、120 r/min搖床繼續(xù)培養(yǎng)16 h, 誘導(dǎo)LaclK蛋白的表達。

非變性條件下6×His標簽重組LaclK蛋白的純化參考QIAexpress Ni-NTA Fast Start Handbook手冊操作。利用Ni-NTA柱親和純化蛋白，洗脫液經(jīng)50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液反復(fù)超濾，脫鹽和除去咪唑。純化的蛋白融于50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，4℃保存?zhèn)溆?。SDS-PAGE電泳分析蛋白純度，Solarbio BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。

1.2.2重組酶活力的測定以2,6-二甲氧基苯酚為底物測定酶活力，測定前3 min在60℃、pH 7.0的反應(yīng)體系內(nèi)468 nm處吸光值的線性變化情況[14]。在標準條件(60℃,pH 7.0 )下，1 min內(nèi)氧化1 μmol 2,6-二甲氧基苯酚所需的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

脫色率(%) =[(A0-At)/A0]×100

A0、At分別為對照組和實驗組反應(yīng)t小時后在596 nm處的吸光值。

對照組不添加酶液以等量的緩沖液代替，每組3個重復(fù)實驗。

1.2.4給酶量對脫色的影響以10 μmol/L乙基紫為底物，測定給酶量25～300 U/L時的脫色率變化。

1.2.5脫色時間對脫色的影響以20 μmol/L乙基紫為底物，給酶量200 U/L，測定不同脫色時間(20～180 min)脫色率的變化。

1.2.6乙基紫濃度對脫色的影響選擇不同濃度(10～100 μmol/L)的乙基紫為底物，在給酶量200 U/L的條件下，測定其脫色情況。

1.2.7pH對脫色的影響以20 μmol/L乙基紫為底物，給酶量200 U/L，在不同pH(3.0～10.0)條件下測定脫色率。pH緩沖體系分別為 50 mmol/L檸檬酸-柃檬酸鈉緩沖液(pH 3.0～5.0)，50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液 (pH 6.0～7.0)，50 mmol/L Tris緩沖液 (pH 8.0～9.0)，50 mmol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 9.0～10.0)。

1.2.8鹵離子對脫色的影響以20 μmol/L乙基紫為底物，給酶量200 U/L，測定不同濃度(10～1 000 mmol/L)的鹵離子(F-、Cl-、Br-、I-)對脫色的影響。

1.2.9有機試劑對脫色的影響以20 μmol/L乙基紫為底物，給酶量200 U/L，考察不同濃度(5%～30%，V/V)的有機試劑(甲醇、乙醇和二甲基亞砜)對脫色的影響。

2　結(jié)果與分析

2.1純酶的制備與酶活測定

用SDS-PAGE分析酶的表達和純化過程，圖1第3泳道為經(jīng)過純化后的LaclK，表明目的蛋白已獲得純化。以2,6-二甲氧基苯酚為底物，LaclK比酶活為0.43 U/mg。

圖1　SDS-PAGE分析純化的LaclKFig.1　SDS-PAGE analysis of the purified LaclK.M.蛋白Maker；1.菌體裂解上清；2.菌體裂解沉淀；3.純化的LaclK。

2.2給酶量對乙基紫脫色的影響

在給酶量為100 U/L 的條件下，LaclK對20 μmol/L乙基紫脫色率為68%；當給酶量達到200 U/L，脫色率增至84%；而繼續(xù)增加給酶量，脫色率不再明顯變化(圖2)。因此，選擇200 U/L為最適給酶量。

圖2　給酶量對脫色的影響Fig.2　Effects of LaclK amount on decolorization of ethyl violet.

2.3接種時間對乙基紫脫色的影響

反應(yīng)20 min，200 U/L LaclK對20 μmol/L乙基紫脫色率為46%；在1 h后脫色率超過了80%；隨著時間的延長，脫色率基本保持穩(wěn)定，為84%(圖3)。因此，選擇1 h為最適接種時間。

圖3　接種時間對脫色的影響Fig.3　Effects of incubation time on decolorization of ethyl violet.

2.4乙基紫濃度對脫色的影響

圖4表明，隨著乙基紫濃度的增加，脫色率降低。乙基紫濃度低于50 μmol/L時，脫色率高于57%：濃度為10 μmol/L時，脫色率達到91%；濃度為20 μmol/L時，脫色率為84%。當濃度達到100 μmol/L時，脫色率僅為5%。乙基紫與酶分子的空間位組效應(yīng)會影響酶的反應(yīng)活性，故乙基紫濃度越高，其脫色率越低[15]。

圖4　乙基紫濃度對脫色的影響Fig.4　Effects of ethyl violet concentration on decolorization of ethyl violet.

2.5pH對乙基紫脫色的影響

由圖5可知，LaclK脫色乙基紫的最適pH在7.0左右，在pH 5～9內(nèi)，保持著較高的脫色率，超過了51%，表明LaclK具有廣泛的pH作用范圍，在中性偏堿條件下也能脫色乙基紫，這是許多真菌漆酶所不具有的[16]。

圖5　pH對脫色的影響Fig.5　Effects of pH on decolorization of ethyl violet.

2.6鹵離子對乙基紫脫色的影響

紡織工業(yè)排放的廢水中通常含有大量的鹵離子，良好的耐鹵特性是酶的工業(yè)應(yīng)用所需要的[17]。鹵離子對漆酶的抑制作用表現(xiàn)在Cl-和Br-作為電子供體的競爭性抑制劑，而F-作為非競爭性抑制劑。此外，鹵離子還能結(jié)合漆酶活性中心的銅離子(type 2和 type 3)發(fā)揮抑制作用[18]。可能由于LaclK不存在典型的type 2和type 3銅離子，所以鹵離子對其抑制作用不是很明顯。如圖6所示，NaCl、NaF和NaBr濃度達到1 mol/L時，乙基紫的脫色率還分別達到53.4%、44.3%和58.0% (圖6)。KI對乙基紫脫色的抑制作用明顯，當體系中存在100 mmol/L KI時，LaclK的脫色能力被完全抑制，這可能與鹵離子不同的供體有關(guān)；Fang等[14]的研究也發(fā)現(xiàn)相同濃度的KCl和NaCl對漆酶活性的影響相差很大。

圖6　鹵離子對脫色的影響Fig.6　Effects of halide ions on decolorization of ethyl violet.

2.7有機試劑對乙基紫脫色的影響

有機試劑作為良好的溶劑，在有機試劑中的反應(yīng)可以拓寬酶的應(yīng)用領(lǐng)域。當脫色體系中存在5%的甲醇、乙醇和二甲基亞砜時，脫色率由83.6%(不加有機試劑)分別變?yōu)?9.9%、68.9%和73.9%；當甲醇、乙醇和二甲基亞砜濃度增大到20%時，其脫色率分別還有36.1%、10.0%和53.4%(圖7)。由于各種原因，如酶構(gòu)象的改變、底物基態(tài)的熱力學(xué)穩(wěn)定性、界面失活等，酶在有機溶劑中的活性會有所損失，從而影響其脫色性能[19,20]。無論如何，結(jié)果表明LaclK具有一定耐受有機試劑的能力，尤其是對二甲基亞砜的耐受性最好。

圖7　有機試劑對脫色的影響Fig.7　Effects of organic solvents on decolorization of ethyl violet.

on decolorization of ethyl violet.

3　討論

有色工業(yè)廢水常呈中性或堿性，且水質(zhì)成分復(fù)雜，包含各種污染物、有機試劑、硫酸鹽、腐殖質(zhì)以及高濃度的鹵離子等[21,22]。以前報道的許多真菌漆酶雖然脫色率高，然而真菌漆酶卻存在著很多的局限性，比如大部分的真菌漆酶主要在酸性和中性條件下發(fā)揮作用，堿性條件下很容易失活[15]；真菌漆酶對鹵離子敏感，在濃度達到100 mmol/L時便會失去活性[23]。

本研究中，在pH 7.0，60℃反應(yīng)1 h，200 U/L的LaclK對10 μmol/L乙基紫脫色率達到91%；當乙基紫濃度達到20 μmol/L時，脫色率仍可維持在80%以上。LaclK展現(xiàn)了在高溫、中性條件下，短時間內(nèi)將染料脫色的性能。此外，LaclK還顯示出耐受高濃度鹵化物NaCl、NaF和NaBr的特點。LaclK在有機溶劑中的耐受性擴大了酶在苛刻條件下的應(yīng)用潛力，這一特性使LaclK具有獨特的優(yōu)勢，如：消除微生物的傳染、增加非極性底物的溶解性、抑制水相反應(yīng)，并能催化許多在水介質(zhì)中不穩(wěn)定的化學(xué)反應(yīng)[24]。

綜上所述，LaclK能夠在中性偏堿性條件下脫色乙基紫，脫色性能優(yōu)良，且具有一定的鹵化物和有機試劑耐受性，在染料廢水的生物修復(fù)中具有一定的應(yīng)用潛力。

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Decolorization of Ethyl Violet by Recombinant Phenol Oxidase LaclK fromKurthiahuakuiiLAM0618T

GUO Xiang1,2, RUAN Zhi-yong2*, SONG Jin-long3, ZHOU Shan2, WANG Yan-wei1, HE Ming-xiong1, LIU Xiao-yang2, HU Guo-quan1*

1.KeyLaboratoryofDevelopmentandApplicationofRuralRenewableEnergy,MinistryofAgriculture,BiogasInstituteofMinistryofAgriculture,Chengdu610041,China;2.Key Laboratory of Microbial Resources Collection and Preservation, Ministry of Agriculture, Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3.Chinese Academy of Fishery Sciences, Beijing 100141, China

ethylviolet;LaclK; Kurthia huakuiiLAM0618T;phenoloxidase;decolorization

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.04.06

2016-03-19; 接受日期：2016-04-11

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(IARRP2014-30);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201403019)資助。

郭翔，碩士研究生，主要從事環(huán)境微生物學(xué)研究。E-mail：gx20093879@163.com。*通信作者：胡國全，研究員，主要從事環(huán)境微生物學(xué)研究。E-mail：huguoquan1@hotmail.com；阮志勇，副研究員,博士，主要從事農(nóng)業(yè)微生物資源發(fā)掘與利用研究。E-mail：ruanzhiyong@caas.cn