布紫云　曲婷麗　趙正保

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【實(shí)驗(yàn)研究】

中藥材鬼針草的定性和定量研究*

布紫云曲婷麗趙正保△

山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院(太原 030001)

摘要：目的初步建立中藥材鬼針草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法以蘆丁和金絲桃苷為對照品，對鬼針草藥材分別采用薄層色譜法和高效液相色譜法進(jìn)行定性和定量研究。結(jié)果建立了以薄層色譜法鑒別鬼針草藥材中蘆丁和金絲桃苷的方法。蘆丁的線性范圍為 3.11～99.55 μg·mL-1，回歸方程為：Y=16.783X-7.895(r = 0.9999，n = 6)，平均加樣回收率為 96.75%，RSD為2.77%(n = 6)；金絲桃苷的線性范圍為 3.14～100.6 μg·mL-1，回歸方程為 Y= 22.425X - 10.389(r = 0.9998，n = 6)，平均加樣回收率為 94.89%，RSD為 1.98%(n = 6)。 結(jié)論本實(shí)驗(yàn)方法簡單，準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于鬼針草的定性鑒別和定量測定，有效控制鬼針草藥材的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：鬼針草；薄層色譜法；高效液相色譜法；蘆?。唤鸾z桃苷

鬼針草(BidenspilosaL.)為菊科鬼針草屬一年生草本植物，又名鬼釵草、粘身草、三葉鬼針草。是我國民間常用藥，史載于唐朝陳藏器《本草拾遺》，具有清熱解毒，活血散瘀之功效，多用于上呼吸道感染，咽喉腫痛，瘧疾，急性黃疸型肝炎，跌打腫痛等[1]。鬼針草所含成分復(fù)雜多樣，主要活性成分為黃酮類化合物，曹園等[2]從鬼針草 95% 乙醇提取物中分離出18個(gè)化合物，分別為蘆丁、金絲桃苷、槲皮素、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等成分。本文建立薄層層析法和高效液相色譜法對鬼針草中黃酮類活性成分蘆丁和金絲桃苷進(jìn)行定性鑒別和定量測定，為有效控制鬼針草藥材的質(zhì)量提供依據(jù)。

1　材料

1.1儀器Agilent 1200 型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，TU-1901 型雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，AL-104 型電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，SB5200-DTDN 型超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)，硅膠 G 板(薄層色譜用，青島海洋化工廠)。

1.2藥材鬼針草藥材 8 批，分別采集于山西運(yùn)城，安徽亳州，福建寧德等地(批號(hào)分別為Y2013001-Y2013003，B2013001-B2013003，201401)，購買于山西太原國藥集團(tuán)(批號(hào)201309，產(chǎn)地河北安國)。經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥系白云娥副教授鑒定為菊科植物鬼針草BidenspilosaL. 的干燥地上部分。

蘆丁對照品(批號(hào) 10080-200707，購于中國食品藥品檢定研究院)，金絲桃苷對照品(批號(hào) 11521-201205，購于中國食品藥品檢定研究院)。甲醇、乙腈(色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)，無水乙醇、乙酸乙酯、甲酸、磷酸等(分析純，天津市北辰方正試劑廠)。

2　試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1薄層鑒別

2.1.1供試品溶液的制備取本品粉末 5.0 g，加甲醇 50 mL，加熱回流 2 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴?10 mL 使溶解，用蒸餾水萃取 2 次，每次 10 mL，合并水層，蒸干，殘?jiān)蛹状技s 5 mL使溶解，作為供試品溶液。

2.1.2對照品溶液的制備取蘆丁對照品和金絲桃苷對照品適量，加甲醇制成每 1 mL各含 0.2 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.3薄層色譜條件參照薄層色譜法[3](附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取對照品和供試品溶液各 5 μL，點(diǎn)于同一硅膠 G 薄層板上，以乙酸乙酯：丁酮：甲酸：水(5：3：1：1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，干燥后置于紫外光燈下(365 nm)觀察特征斑點(diǎn)顏色。結(jié)果顯示在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同的黃色熒光斑點(diǎn)。

1 金絲桃苷；2 蘆??；3-10 鬼針草供試品圖1　薄層色譜鑒別結(jié)果

2.2含量測定

2.2.1測定波長的選擇取蘆丁和金絲桃苷對照品溶液，采用紫外可見分光光度法從 200～760 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示，蘆丁和金絲桃苷在 362 nm處有強(qiáng)吸收峰，故選擇 362 nm為檢測波長。

2.2.2色譜條件和系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)Welch Ultimate LP- C18 色譜柱(250 mm×4. 6 mm，5×m)；流動(dòng)相：乙腈：0.1% 磷酸水溶液(17.5：82.5)；流速：1.0 mL· min-1；檢測波長：362 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下，取對照品溶液、供試品溶液各 10 μL，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖1。理論塔板數(shù)按蘆丁計(jì)算不低于 3000。蘆丁和金絲桃苷與其它組分離良好。

圖2　對照品和鬼針草藥材的HPLC

2.2.3對照品溶液的制備精密稱定蘆丁對照品 2.75 mg，金絲桃苷對照品 2.70 mg，置 25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為對照品儲(chǔ)備液，每 1 mL含蘆丁為 99.55 μg，含金絲桃苷為 100.6 μg。

2.2.4供試品溶液的制備取 105 ℃下干燥后的鬼針草藥材粉末約 1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加70% 的乙醇 60 mL，密塞，于 40 ℃下超聲處理(功率 250 W，頻率 40 kHz)20 min，放冷，搖勻，濾過，洗滌殘?jiān)蜑V紙。回收溶劑，加甲醇溶解，定容至 10 mL 容量瓶中。用 0.45 μm 的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.5線性關(guān)系考察取混合對照品儲(chǔ)備液，精密量取 0.3、0.6、1.3、2.5、5.0 mL，分別置于10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。在上述色譜條件下分別進(jìn)樣10 μL。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。蘆丁回歸方程為：Y=16.783X-7.895(r= 0.9999，n= 6)，金絲桃苷回歸方程為Y= 22.425X- 10.389(r= 0.9998，n= 6)。表明蘆丁在 3.11～99.55 μg·mL-1，金絲桃苷在3.14～100.6 μg·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2.6精密度試驗(yàn)精密吸取同一對照品溶液(蘆丁濃度為 12.44 μg·mL-1)10 μL，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣 6 次，蘆丁峰面積平均值為 196.77，RSD 0.89%，金絲桃苷峰面積平均值為 264.60，RSD 0.89%。表明儀器精密度良好。

2.2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液(批號(hào)：201309)，分別于0、2、4、8、12 及 24 h 各進(jìn)樣 1 次，測得峰面積值，蘆丁峰面積平均值為 160.8，RSD 2.38%，金絲桃苷峰面積平均值為 190.78，RSD 2.25%。表明供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8重復(fù)性試驗(yàn)取同一批鬼針草藥材(批號(hào)：201309)約 1.0 g，精密稱定，平行制備 6份供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析。蘆丁平均含量為 100.6 μg·g-1，RSD 2.49%；金絲桃苷平均含量為 90.79 μg·g-1，RSD 2.31%。

2.2.9加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的鬼針草樣品(批號(hào)：201309，蘆丁含量為 100.6 μg·g-1，金絲桃苷含量為 90.79 μg·g-1)6 份，每份 0.5 g，精密稱定，分別精密加入 0.5 mL的混合對照品儲(chǔ)備液(蘆丁濃度為 99.55 μg·mL-1，金絲桃苷濃度為 100.6 μg·mL-1)，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析。蘆丁平均加樣回收率為 96.75%，RSD 2.77%，金絲桃苷平均加樣回收率為 94.89%，RSD 1.98%。結(jié)果見表1和表2。

表1　蘆丁回收率測定

表2　金絲桃苷回收率測定

2.2.10蘆丁和金絲桃苷的含量測定取 105 ℃ 下干燥后的鬼針草藥材，每份約 1.0 g，精密稱定，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行 HPLC 分析，8批樣品蘆丁含量不低于73.94μg·g-1，金絲桃苷含量不低于93.46μg·g-1，結(jié)果見表 3。

表3　8批樣品的含量測定結(jié)果

3　討論

在薄層鑒別[4]中，先后采用了乙酸乙酯-乙醇-水(10：5：3)、乙酸乙酯-甲酸-水(8：1：1)、乙酸乙酯-乙酰丙酮-冰乙酸-水(2：1.5：0.2：0.5)、乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5：3：1：1)等展開劑，結(jié)果顯示在乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5：3：1：1)展開系統(tǒng)中，蘆丁和金絲桃苷斑點(diǎn)清晰，分離效果良好。

在含量測定供試品制備工藝考察中，比較了不同提取方法(回流提取、超聲)，不同提取溶劑(甲醇、60% 乙醇、70% 乙醇、80% 乙醇)，不同提取時(shí)間(20 min、30 min、40 min)，溶劑用量(40 mL、50 mL、60 mL)對試驗(yàn)結(jié)果的影響，結(jié)果顯示70% 的乙醇 60 mL，超聲處理 20 min，蘆丁和金絲桃苷的含量均最高。

在選定波長時(shí)，蘆丁和金絲桃苷在 258 nm 和 362 nm 處均有強(qiáng)吸收，但 362 nm 處色譜圖峰形好，干擾少，故選擇 362 nm 為檢測波長。試驗(yàn)先后進(jìn)行了乙腈-0.1% 甲酸溶液、乙腈-0.6% 磷酸溶液、甲醇- 0.04% 磷酸溶液、乙腈-0.1% 磷酸溶液等多種流動(dòng)相系統(tǒng)[5]，最終確定流動(dòng)相為乙腈-0.1% 磷酸溶液(17.5：82.5)，此時(shí)蘆丁和金絲桃苷與雜質(zhì)峰分離度良好，且相互之間無影響。

鬼針草主要活性成分為黃酮類，主要有蘆丁、海生菊苷、金絲桃苷、異槲皮苷等，研究表明鬼針草中的黃酮類成分有減輕大鼠內(nèi)毒素性急性肺損傷，降低氧化應(yīng)激損傷程度，并對肝纖維化大鼠具有防治作用等多種藥理活性[6]，本法對其黃酮類成分蘆丁和金絲桃苷采用高效液相色譜法進(jìn)行了含量測定，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，方法簡單、靈敏，可用于鬼針草的質(zhì)量控制。鬼針草中含有的聚炔類成分鬼針聚炔苷和鬼針聚炔苷B是其抗癌的活性成分，對體外培養(yǎng)的 HL-60、V937白血病細(xì)胞有明顯的抑制作用[7],張麗等[8]利用自制的鬼針聚炔苷對照品對其進(jìn)行了含量測定。本實(shí)驗(yàn)未能獲得符合含量測定用的鬼針聚炔苷對照品，故未測定其中含量。

參考文獻(xiàn)

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*基金項(xiàng)目：山西省中藥材中藥飲片地方標(biāo)準(zhǔn)研究項(xiàng)目基金“鬼針草地方標(biāo)準(zhǔn)研究” (No.2013001A)

通訊作者△

doi:10.3969/j.issn.1003-8914.2016.02.028

文章編號(hào)：1003-8914(2016)-02-0211-03

收稿日期：(本文校對：劉言言2015-03-19)

Qualitative and Quantitative Study onBidenspilosaL.

BU ZiyunQU TingliZHAO Zhengbao△

(School of Pharmaceutical Science, Shanxi Medical University, Shanxi, Taiyuan 030001, China)

Abstract：ObjectiveTo establish the quality standard for bidens pilosa L.. MethodsTaking rutin and hyperoside as references, Bidens pilosa L. was identified by TLC, and the content of rutin and hyperoside were determined by HPLC. ResultsThe identifying method of rutin and hyperoside by TLC were established. The determination method for the content of rutin and hyperoside was established. The calibration curve of rutin was liner in the range of 3.11～99.55 μg·mL-1. The regression equation was Y=16.783X-7.895 (r=0.9999，n=6). The average recovery was 96.74%, RSD was 2.76% (n=6). The calibration curve of hyperoside was liner in the range of 3.14～100.6 μg·mL-1. The regression equation was Y=22.425X-10.389 (r=0.9998, n=6). The average recovery was 94.89%, RSD was 1.98% (n=6). ConclusionThe method is simple and accurate, and has high reproducibility. It can effectively control the quality of bidens pilosa L. by qualitative identification and quantitative determination.

Key words：Bidens pilosa L.; TLC; HPLC; Rutin; Hyperoside