顏國(guó)富　杜亮亮

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滋腎活血丸對(duì)DN大鼠腎臟保護(hù)作用的研究*

顏國(guó)富杜亮亮

湖南省岳陽市中醫(yī)院內(nèi)分泌科(岳陽 414000)

摘要：目的觀察滋腎活血丸對(duì)DN大鼠腎臟的保護(hù)作用及足細(xì)胞損傷的影響。方法40只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、滋腎活血丸組、苯那普利組，每組各10只，測(cè)定生化指標(biāo)；光鏡檢查腎組織病理變化，電鏡及免疫熒光法檢測(cè)腎組織及尿液中足細(xì)胞變化等并進(jìn)行觀察。結(jié)果實(shí)驗(yàn)12周后，模型組大鼠血糖、24 小時(shí)尿蛋白定量、BUN、Scr較正常對(duì)照組明顯增高(P<0.05)；滋腎活血丸組和苯那普利組與模型組比較大鼠24 h尿蛋白定量、BUN、Scr均有不同程度降低(P<0.05)，但滋腎活血丸組遠(yuǎn)期療效更為顯著。結(jié)論滋腎活血丸可減輕糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞損傷，具有一定的腎保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：滋腎活血丸；糖尿病腎??；腎功能；足細(xì)胞

糖尿病腎病( diabetic nephropathy，DN)，是引起成人后天性終末期腎病的主要原因。研究表明，DN所引起的一系列癥狀均與蛋白尿相關(guān)，導(dǎo)致蛋白尿的關(guān)鍵因素是足細(xì)胞損傷[1～2]。筆者的前期研究表明滋腎活血丸對(duì)糖尿病腎病有明顯保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了滋腎活血丸在糖尿病大鼠模型中的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量(160±20) g，10周齡，由中南大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：2012A066。

1.2試驗(yàn)藥物及儀器設(shè)備鏈脲佐菌素(STZ)為Sigma公司產(chǎn)品；苯那普利片由北京諾華制藥有限公司提供(國(guó)藥準(zhǔn)字H20000292)；滋腎活血丸由我院中藥房提供(批號(hào):008213)；兔抗大鼠Podocalyxin多抗及FITC-山羊抗兔IgG,購自SANTA CRUZ公司。血糖儀為美國(guó)強(qiáng)生公司產(chǎn)品；全自動(dòng)多功能生化分析儀為日本HITACH公司產(chǎn)品；光學(xué)顯微鏡為日本OLYMPUS公司產(chǎn)品。

1.3模型制作三聯(lián)法制備2型糖尿病腎病模型：(1)切除大鼠右腎, 繼而高糖高脂飲食誘導(dǎo)。(2)小劑量鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射，破壞大鼠的部分胰島B細(xì)胞，使大鼠出現(xiàn)糖尿病腎病的早期病變?nèi)纾耗I小球?yàn)V過率增加、微量白蛋白尿等。高糖高脂飲食：常規(guī)飼料加 20%蔗糖，10%豬油、2.5%膽固醇。手術(shù)方法：大鼠腹腔注射氯氨酮(70mg/kg)麻醉后將右腎切除。STZ為sigma公司產(chǎn)品，按30mg/kg腹腔注射，造模時(shí)間共 6周。

1.4動(dòng)物分組與給藥方法40只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、糖尿病腎病模型組(模型組)、滋腎活血丸組、苯那普利組，每組各10只。滋腎活血丸組每日每只灌胃滋腎活血丸(3 g/kg/d)，苯那普利組每日每只灌胃苯那普利(2.5 g/kg/d)，對(duì)照組大鼠腹腔注射相應(yīng)的檸檬酸鹽溶液，每日給予等量的飲用水，模型組每日給予等量的飲用水。實(shí)驗(yàn)周期為12周。

1.5標(biāo)本提取及指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1生化指標(biāo)分別在實(shí)驗(yàn)的2、4、6、8、12周末測(cè)定大鼠血糖及24小時(shí)尿蛋白定量。12周后測(cè)定腎臟指數(shù)(RI) =左腎質(zhì)量(LRW)/大鼠體質(zhì)量(BW)×100。肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、Scr、BUN；均采用全自動(dòng)多功能生化分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.5.2光鏡觀察12周末采血后取部分腎組織放入10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)切片并行HE染色，采用光鏡觀察結(jié)果。

1.5.3電鏡觀察觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的病理改變及腎微血管超微結(jié)構(gòu)的改變。每只大鼠腎組織在42000X放大倍數(shù)下觀察，取30個(gè)視野，每只大鼠最少觀察100個(gè)足細(xì)胞，使用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件采集足細(xì)胞數(shù)量，裂孔隔膜數(shù)量及范圍，觀察腎小球基底膜的厚度。

1.5.4免疫熒光染色檢測(cè)(1)各組均收集大鼠24小時(shí)尿液40ml，PBS重懸尿沉渣兩次后細(xì)胞涂片；(2)4%多聚甲醛固定20 分鐘后PBS洗1次，再滴加0.2%Triton-X100，5分鐘后PBS洗3次；然后3%BSA封閉40分鐘后滴加抗兔抗大鼠podocalyxin多抗(1:200)，4℃孵育；(3)第二天采用PBS漂洗后加山羊抗兔IgG-FITC(1:1000)，避光孵育1小時(shí)后再次漂洗，Hoechst(1:2 000)細(xì)胞核染10分鐘后漂洗，擦干封片。(4)采用全自動(dòng)多功能熒光顯微鏡觀察，發(fā)綠色熒光者為陽性。

2　結(jié)果

2.1對(duì)大鼠血糖的影響見表1。

組別2周4周6周8周12周對(duì)照組4.79±0.924.50±1.004.75±0.985.29±0.264.74±1.04模型組17.80±1.5417.51±2.0318.55±1.9719.63±2.1120.76±1.771)苯那普利組17.11±1.7717.00±1.0618.53±2.2320.62±2.4120.33±1.651)2)滋腎活血丸組18.02±2.2517.28±1.5017.42±1.0818.20±1.0118.23±2.061)2)3)

注：與對(duì)照組比較1)P<0.05，與模型組比較2)P>0.05，與苯那普利組比較3)P>0.05。

2.2對(duì)大鼠尿蛋白的影響見表2。

表2　各組大鼠尿蛋白變化　±s)

注：與對(duì)照組比較1)P<0.05，與模型組比較2)P<0.05，與苯那普利組比較3)P<0.05。

2.3對(duì)大鼠腎臟的影響見表3。

表3　各組對(duì)大鼠腎臟的影響　±s)

注：與對(duì)照組比較1)P<0.05，與模型組比較2)P<0.05，與苯那普利組比較3)P<0.05，與苯那普利組比較4)P>0.05。

2.4腎組織病理學(xué)觀察

2.4.1光鏡檢查對(duì)照組：腎小球、腎小管及腎間質(zhì)無明顯病理改變。模型組：腎小球體積增大，毛細(xì)血管腔受壓變窄，基底膜增厚，系膜物質(zhì)增多，腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變。苯那普利組：毛細(xì)血管叢內(nèi)血管腔尚清晰，系膜區(qū)增寬，部分基底膜增厚。滋腎活血丸組：毛細(xì)血管叢內(nèi)血管腔清晰，系膜區(qū)稍增寬，腎小囊與正常組比較無差異，部分基底膜稍增厚。

2.4.2電鏡檢查對(duì)照組：足細(xì)胞密度正常，足突排列整齊，未見融，系膜區(qū)ECM量正常。模型組：足細(xì)胞數(shù)量明顯減少，系膜增寬，基底膜可見彌漫性增厚，變性，足突融合。滋腎活血丸組：足突融合減輕，部分區(qū)域可見完整足突排列。苯那普利組：可見與滋腎活血丸組類似改變。

3　討論

DN的主要病理實(shí)質(zhì)為與血糖代謝異常有關(guān)的腎小球硬化癥，病理特征為腎小球細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM) 過度積聚，基底膜增厚，系膜增寬，間質(zhì)纖維化及腎小球硬化。糖尿病腎病相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，高血糖可直接引起及腎小球硬化，腎小球?yàn)V過率增加，最終導(dǎo)致蛋白尿。研究還表明DN患者足細(xì)胞數(shù)量減少與腎小球的硬化程度呈正相關(guān)[3]。足細(xì)胞數(shù)量減少最主要的原因?yàn)樽慵?xì)胞從腎小球基底膜的脫落及凋亡，而使足細(xì)胞從尿液丟失增多。足細(xì)胞可通過分泌ECM及相關(guān)降解酶類來調(diào)節(jié)腎小球基膜(GBM)代謝[4]，能維持GBM代謝平衡，增加足細(xì)胞與GBM之間的粘附，有效保障腎臟正常的濾過功能。長(zhǎng)期持續(xù)的高血糖可以下調(diào)Podocalyxin的表達(dá)，引發(fā)足細(xì)胞的分泌功能，最終導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生[5]。關(guān)于修復(fù)DN所致的濾過膜的損傷，廣大醫(yī)務(wù)工作者一直認(rèn)為具有不可逆性，最終難免進(jìn)入透析期，目前已有研究表明多種中藥對(duì)DN有重要的治療作用[6～8]，可以作為研究治療DN的新途徑。滋腎活血丸為我院內(nèi)分泌專科經(jīng)驗(yàn)方滋腎活血湯經(jīng)反復(fù)臨床試驗(yàn)，改良劑型，自行研發(fā)的院內(nèi)制劑之一，臨床應(yīng)用多年，具有明顯降低患者24小時(shí)尿蛋白含量及顯著改善患者腎功能的作用。組方中以經(jīng)方六味地黃丸滋補(bǔ)腎陰，輔以黃芪補(bǔ)氣固表、利尿托毒，丹參、水蛭、益母草、鬼箭羽活血祛瘀、 利水消腫，佐少量蒼術(shù)、雞內(nèi)金、大黃即可健脾燥濕、又可逐瘀通經(jīng)。課題組前期臨床研究表明滋腎活血丸對(duì)于患者血脂、血糖代謝的影響與兩組患者基礎(chǔ)治療相關(guān)，長(zhǎng)期服用對(duì)于患者糖化血紅蛋白含量的下降趨勢(shì)呈正相關(guān)[7～8]，可有效降低高血糖對(duì)足細(xì)胞的毒性作用，有效保護(hù)患者腎功能。

本研究結(jié)果顯示，與正常大鼠比較，模型組大鼠造模成功后在高血糖不斷作用下逐漸出現(xiàn)尿蛋白增多、腎臟病理損傷等DN特征性表現(xiàn)，后期出現(xiàn)腎功能受損。統(tǒng)計(jì)分析表明，滋腎活血丸組與苯那普利組與模型組比較，二者均能不同程度改善DN大鼠腎功能，降低血清肌酐及尿素氮水平，用藥后腎組織病理損傷也明顯減輕。通過對(duì)大鼠蛋白尿影響的研究表明，兩治療組均能不同程度的減少DN大鼠蛋白尿，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P<0.05，且滋腎活血丸組在遠(yuǎn)期(8周至12周)療效優(yōu)于苯那普利組(經(jīng)比較P<0.05)，說明滋腎活血丸與苯那普利都具有腎保護(hù)作用，在消除蛋白尿方面滋腎活血丸的遠(yuǎn)期療效優(yōu)于苯那普利組。兩組大鼠血糖與模型組比較有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究提示，滋腎活血丸能夠通過對(duì)足細(xì)胞的修復(fù)，改善DN患者蛋白尿，對(duì)早期DN的腎臟起到保護(hù)性作用，有望為臨床藥物開發(fā)和中西醫(yī)、藥結(jié)合治療腎臟疾病探索出一條新的途徑。

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*基金項(xiàng)目：湖南省中醫(yī)藥管理局資助課題(No.2013120)

doi:10.3969/j.issn.1003-8914.2016.01.025

文章編號(hào)：1003-8914(2016)-01-0054-03

收稿日期：(本文校對(duì)：李淑君2015-04-10)

The Study on the protective effect of Zishen Huoxue Pills on Kidney of DN rats

YAN GuofuDU Liangliang

(Department of Endocrinology, Yueyang Hospital of Traditional Chinese Medicine, Hunan, Yueyang 414000, China)

Abstract：ObjectiveTo observe the protective effect of Zishen Huoxue pills on the kidney of DN rats as well as the impact on podocyte injury. Method40 rats were randomly divided into control group, the model group, the Zishen Huoxue pills group and the benazepril group, and each group had 10 rats. Their biochemical indicators were determined. The renal biopsy pathology was checked through light microscopy. The podocyte changes in renal tissue and urine were observed by electron microscopy and immuno fluorescence method. ResultsAfter experiments for 12 weeks, the blood glucose, the urine protein in 24 hours, BUN and Scr in rats of the model group were significantly higher than those of the control group (P<0.05). The urine protein in 24 hours, BUN and Scr in rats of the Zishen Huoxue pills group and the benazepril group declined in different degrees compared with the model group (P<0.05). The Zishen Huoxue pills group had remarkable long-term curative effects. Conclusion: The Zishen Huoxue pills can relieve the podocyte injury of the rats with diabetic nephropathy, and had certain renal protective effect.

Key words：Zishen Huoxue pills; Diabetic nephropathy; Renal function; Podocyte