李景龍

(安陽市人民醫(yī)院骨科，河南　安陽　455002)

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激素性股骨頭壞死患者血清與壞死組織中受體活化因子配基的表達

李景龍

(安陽市人民醫(yī)院骨科，河南安陽455002)

目的探討激素性股骨頭壞死(DNFH)患者血清Ⅰ前膠原氨基前肽(PINP)、Ⅰ型膠原C型肽(CTX)、骨鈣素(OST)的表達與壞死組織中骨保護素(OPG)核因子(NF)-κB受體活化因子配基(RANKL)表達的相關性。方法2013年7月至2015年6月篩選99例激素性ONFH病人，手術中取得其骨髓組織，同期股骨頸骨折病人術中取得的骨髓組織49例作為對照。對標本骨髓組織采用貼壁法分離培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細胞，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測骨髓基質(zhì)細胞OPG、RANKL表達水平，并計算OPG/RANKL比值。同時抽取兩組病人外周靜脈血檢測血清PINP、CTX、OST表達水平。結(jié)果ONFH組與對照組比較，PINP、CTX、OST水平明顯升高(P<0.05)；兩組外周血血清PINP、CTX、OST水平與壞死組織中OPG、RANKL水平分別呈正相關(P<0.05)，與OPG/RANKL的比值呈負相關(P<0.05)。結(jié)論激素性ONFH時骨代謝活躍，與骨髓基質(zhì)細胞OPGRANKL表達及比值有關。

糖皮質(zhì)激素；股骨頭壞死；骨髓基質(zhì)細胞；核因子-κB

股骨頭壞死(ONFH)的病因包括創(chuàng)傷性因素和非創(chuàng)傷性因素。前者的病因及發(fā)病機制十分明確，而非創(chuàng)傷性因素則較為復雜，最常見者包含糖皮質(zhì)激素應用和酒精中毒兩種〔1〕。骨保護素(OPG)和核因子-κB受體活化因子配基(RANKL)直接決定破骨細胞的分化與功能發(fā)揮，二者共同構(gòu)成調(diào)節(jié)骨重建的橫軸旁分泌系統(tǒng)〔2〕。OPG/RANKL系統(tǒng)在骨質(zhì)疏松、骨腫瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展以及治療方面均有較深入的研究，但在激素性ONFH中的研究較少。本研究旨在探討激素性ONFH患者血清Ⅰ前膠原C型肽(PINP)、Ⅰ型膠原C型肽(CTX)、骨鈣素(OST)的表達與壞死組織中ORG、RANKL表達的關聯(lián)性。

1　材料與方法

1.1研究對象2013年7月至2015年6月進入某醫(yī)院骨科就診的ONFH患者99例。入組標準：①年齡≥18歲；②激素應用時間不低于1個月，或大劑量沖擊使用激素時間超過1 w；③根據(jù)患者病史、癥狀、體征、影像學檢查(X線平片、CT 或 磁共振檢查)，診斷采用中華醫(yī)學會骨科分會制定的《成人股骨頭壞死診療標準專家共識(2012年版)》；④患者近半年內(nèi)未服用過對骨代謝有影響的藥品，包括抗驚厥藥物、利尿藥、鈣制劑、D族維生素類似物、二膦酸鹽類藥物等。剔除標準：因減壓病、酒精性、感染等其他因素所導致的致ONFH。ONFH組患者入院后均進一步完善相關化驗檢查，進行雙側(cè)髖關節(jié)磁共振檢查、雙側(cè)髖關節(jié)CT掃描、拍攝骨盆平片，本研究采用1996年國際骨循環(huán)協(xié)會推薦的國際骨循環(huán)研究會(ARCO)分期方法進行分期。其中男65例，女34例；年齡35～75〔平均(56.3±6.7)〕歲。其中Ⅱ期23例(23.2%)，Ⅲ期29例(29.3%)，Ⅳ期47例(47.5%)；累及單側(cè)股骨頭41例(41.4%)，累及雙側(cè)58例(58.6%)。選擇同期因股骨頸骨折入院患者49例作為對照組，男30例，女19例；年齡31～72〔平均(54.2±6.5)〕歲；病程1～7 d；均未接受激素治療。

1.2方法

1.2.1主要實驗設備CO2培養(yǎng)箱(美國Forma Scientific公司)；超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；電子天平(上海恒剛儀器儀表有限公司)；離心機(德國SIGMA)；倒置相差顯微鏡及數(shù)字照相系統(tǒng)(日本Nikon TE-2004)；光學顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)；組織切片機(德國Leica公司)。

1.2.2實驗取材對激素性ONFH進行髓芯減壓治療的患者，經(jīng)由骨穿針及(或)刮匙吸取或刮取壞死股骨頭的松質(zhì)骨，對接受帶血管骨瓣移植的患者及股骨頭置換術的患者采集手術所取出股骨頭的松質(zhì)骨。所取組織經(jīng)過肝素化后與等量無血清高糖DMEM培養(yǎng)液混勻、離心后收集沉淀細胞，進行骨髓基質(zhì)細胞培養(yǎng)。至培養(yǎng)第8～10天后當骨髓基質(zhì)細胞大約80%發(fā)生融合時，收集細胞，行酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測測定RANKL和OPG水平，并計算比值。

1.2.3PINP、CTX、OST檢測方法ONFH組于手術治療前空腹6 h，經(jīng)肘正中靜脈抽取靜脈血10 ml，加入含抗凝劑的真空采血管中充分混勻，采用全自動發(fā)光電化學法進行檢測，并記錄PINP、CTX、OST 的含量。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2　結(jié)　果

2.1兩組外周血血清PINP、CTX、OST水平變化ONFH組外周血血清PINP、CTX、OST含量均明顯高于對照組(均P<0.05)。見表1。

表1　兩組患者外周血清PINP、CTX、OST含量變化

2.2兩組壞死組織中OPG、RANKL及OPG/RANKL變化ONFH組壞死組織中OPG、RANKL含量及OPG/RANKL比值明顯高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2　兩組壞死組織中OPG、RANKL含量及其比值的變化值)

2.3兩組外周血血清PINP、CTX、OST水平與壞死組織中OPG、RANKL及OPG/RANKL的比值的關聯(lián)兩組外周血血清PINP水平與壞死組織中OPG、RANKL水平呈正相關(Pearson系數(shù)為0.869，R2=0.646，P<0.05)，與OPG/RANKL的比值呈負相關(Pearson系數(shù)為-0.288，R2=0.327，P<0.05)。CTX水平與壞死組織中OPG、RANKL水平呈正相關(Pearson系數(shù)為0.794，R2=0.514，P<0.05)，與OPG/RANKL的比值呈負相關(Pearson系數(shù)為-0.326，R2=0.89，P<0.05)。OXT水平與壞死組織中OPG、RANKL水平分別呈正相關(Pearson系數(shù)為0.856，R2=0.637，P<0.05)，與OPG/RANKL的比值呈負相關(Pearson系數(shù)為-0.421，R2=0.467，P<0.05)。

3　討　論

ONFH后往往會伴隨有新骨生成并逐漸替代壞死骨組織的骨代謝過程。有研究指出激素性ONFH病人血清中骨代謝標記物水平明顯高于正常人群，主要包括PINP、CTX和OST，這表明病人在ONFH發(fā)生后其骨吸收和合成的速率均有所加快〔3〕。

大量研究顯示，糖皮質(zhì)激素可能是通過下調(diào)成骨細胞內(nèi)Run相關轉(zhuǎn)錄因子(Runx)2、骨形態(tài)蛋白(BMP)2和OPG mRNA表達數(shù)量，抑制骨組織生成，大幅降低骨組織的修復能力，提升破骨細胞的活性，促進骨質(zhì)吸收過程，引發(fā)并最終導致骨質(zhì)疏松，骨密度降低，股骨頭中的骨小梁發(fā)生微骨折，局部小梁間的微循環(huán)遭到破壞后發(fā)生中斷，引發(fā)缺血性ONFH〔3～5〕。

間充質(zhì)干細胞(MSCs)具有多向分化、免疫調(diào)節(jié)的特性，不僅能夠歸巢至損傷組織，抑制受損組織發(fā)生的免疫反應和過度炎性反應，MSCs還具有向多種組織、細胞分化的潛能，因此在創(chuàng)傷修復、組織功能再生與重建、免疫調(diào)節(jié)等領域應用前景廣闊〔6〕。骨髓MSCs是骨髓中存在的多能干細胞，是成骨細胞的前體細胞，能夠分泌很多種細胞因子，其中OPG和RANKL在骨代謝的調(diào)節(jié)過程中承擔著非常重要的功能。通過檢測骨髓MSCs中OPG和RANKL的表達水平，可以揭示骨骼新陳代謝的所處的狀態(tài)，對疾病的轉(zhuǎn)歸做出準確的預判〔7〕。

此外，糖皮質(zhì)激素也可通過上調(diào)RANKL。RANKL也稱作OPGL，是位于破骨細胞表面的核因子-κB受體活化因子的配體，主要在成骨細胞與其前體細胞表達，經(jīng)過旁分泌途徑與破骨細胞的前體細胞及其破骨細胞表面的核因子κB受體活化因子的配體進行結(jié)合，最終促使破骨細胞的形成及活化。OPG是由骨組織中的成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞經(jīng)合成、分泌而來，為RANKL的誘餌受體，能夠競爭性結(jié)合PANKL，封閉并與之結(jié)合，阻遏破骨細胞的產(chǎn)生與活化，最終抑制破骨細胞產(chǎn)生的骨吸收過程〔7～9〕。

Ⅰ型膠原占人體膠原含量的首位，在礦化骨中屬于唯一的膠原成分，在骨基質(zhì)有機成分所占比例超過90%，由成骨細胞生產(chǎn)并釋放出前膠原纖維，在細胞外分解產(chǎn)生PINP，因此PINP在血清中的水平能夠反映成骨細胞合成釋放骨膠原的能力，PINP可作為監(jiān)測成骨細胞活性、成骨能力和骨形成速率的特異性生化指標。PINP目前已經(jīng)廣泛應用于惡性腫瘤發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的檢測診斷當中〔10〕。本研究揭示出股骨頭壞死所造成骨破壞刺激成骨細胞活性增強，修復遭到破壞的骨組織，造成PINP升高。

CTX作為I型膠原細胞外降價產(chǎn)物之一，與既往檢測骨吸收的檢驗指標相比顯著不同，CTX源自成熟的膠原纖維，在人體內(nèi)無法被進一步降解和重新利用，因此通過CTX可以準確反映體內(nèi)成熟膠原纖維的情況。在骨基質(zhì)重建過程中，I型膠原大量分解并產(chǎn)生CTX，通過檢測血清中CTX的水平即可準確地反映出骨吸收狀態(tài)〔11〕。本研究揭示出ONFH所造成骨破壞刺激成熟的膠原纖維參與骨基質(zhì)重建，造成CTX升高。

OST源于成骨細胞的合成并釋放，其他組織器官無法產(chǎn)生OST，因此血清OST含量已被作為骨代謝轉(zhuǎn)換的一個敏感指標，來檢測代謝性骨病的骨轉(zhuǎn)換率〔11〕。本研究揭示出ONFH骨組織礦化速度加快，造成OST升高。

1Corrado A,Neve A,Macchiarola A,etal.RANKL/OPG ratio and DKK-1 expression in primary osteoblastic cultures from osteoarthritic and osteoporotic subjects〔J〕.J Rheumatol,2013;40(5):684-94.

2Jiang C,Shang J,Li Z,etal.Lanthanum chloride attenuates osteoclast formation and function via the downregulation of rankl-Induced nf-κb and nfatc1 activities〔J〕.J Cell Physiol,2016;231(1):142-51.

3馬小妮，葛寶華，陳克明，等.淫羊藿苷通過OPG/RANRL信號途經(jīng)調(diào)節(jié)骨吸收的機理研究〔J〕.中國骨質(zhì)疏松雜志，2013；19(1)：1-5.

4孫闖，逮代鋒，周勇，等.淫羊藿苷對小鼠/骨溶斛膜型OPG/RANRL基因及其蛋白表達的影響〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2012；12(34)：6647-50.

5王天勝,滕壽發(fā),張英霞,等.骨髓基質(zhì)干細胞移植在激素性股骨頭壞死治療中的作用機制研究〔J〕.臨床和實驗醫(yī)學雜志,2015;14(1):10-2.

6沈水娟,李青華,何劍零,等.原發(fā)性腎病綜合征患者核因子 KB 受體活化因子配體,護骨素及骨代謝標記物的變化〔C〕.浙江省腎臟病學術年會論文匯編,2014.

7李寧博.晚期激素性股骨頭壞死股骨頭骨組織中相關基因表達〔D〕.鄭州：鄭州大學,2014.

8孫云明.髓芯減壓聯(lián)合干細胞移植對股骨頭壞死患者血清 PINP,CTX,OST 水平的影響〔J〕.中國老年學雜志,2015;35(14):3972-3.

9董松格.激素性股骨頭壞死患者血清 PINP,CTX,OST 的變化及意義〔D〕.泰安：泰山醫(yī)學院,2013.

10Boyce B F,Xing L.The RANKL/RANK/OPG pathway〔J〕.Curr Osteoporos Rep,2007;5(3):98-104.

11Sokos D,Everts V,Vries TJ.Role of periodontal ligament fibroblasts in osteoclastogenesis:a review〔J〕.J Periodontal Res,2015;50(2):152-9.

〔2015-12-31修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.087

李景龍(1978-)，男，主治醫(yī)師，主要從事脊柱關節(jié)臨床研究。

8681.8/8684.2

A

1005-9202(2016)14-3540-02；