王貽蓮，謝雪迎，扈進(jìn)冬，陳凱，楊合同，李紀(jì)順

(山東省科學(xué)院生物研究所，山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

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【農(nóng)業(yè)微生物】

霜霉病高效生防菌株BCJB01發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

王貽蓮，謝雪迎，扈進(jìn)冬，陳凱，楊合同，李紀(jì)順*

(山東省科學(xué)院生物研究所，山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

摘要：為提高霜霉病高效生防菌株Bacillus cereus BCJB01的發(fā)酵水平，通過正交試驗(yàn)、綜合優(yōu)選及糖分流加試驗(yàn)，優(yōu)化BCJB01的發(fā)酵培養(yǎng)基。優(yōu)化出的培養(yǎng)基配方的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為：玉米粉2.00%、豆粕粉1.00%、四水氯化錳0.003 0%、十二水磷酸氫二鈉0.30%、二水磷酸二氫鈉0.15%、七水硫酸鎂0.035%、氯化鈣0.10%和酵母提取物0.30%，接菌后6～12 h流加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%糖。本研究?jī)?yōu)化的培養(yǎng)基配方在接種量為3%(V/V)，轉(zhuǎn)速為180 r /min，溫度為 30 ℃的搖床振蕩培養(yǎng)至66 h時(shí)，芽孢率近90%，菌體數(shù)量達(dá)100×108cfu/mL以上。

關(guān)鍵詞：蠟樣芽孢桿菌；霜霉??；發(fā)酵培養(yǎng)基；正交設(shè)計(jì)；綜合優(yōu)選

霜霉病是作物上普遍發(fā)生的一種世界性病害，常見的有瓜類霜霉病和葡萄霜霉病。瓜類霜霉病不僅侵染甜瓜和黃瓜，還對(duì)葫蘆科的西瓜、南瓜、絲瓜及蛇瓜等12 種瓜類作物造成危害[1]。葡萄霜霉病是葡萄的重要病害，嚴(yán)重影響葡萄生長(zhǎng)及果實(shí)產(chǎn)量，給葡萄產(chǎn)業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。

化學(xué)防控一直是控制霜霉病的主要措施，多數(shù)果蔬產(chǎn)區(qū)需要多次、大量施用化學(xué)藥劑才能成功防控其危害[4]，同時(shí)易引起抗藥性增強(qiáng)、病害再猖撅及殘留加重等問題。瓜果蔬菜是直接食用的，不能用高毒、高殘留農(nóng)藥，因此，生物防治成為防控果蔬霜霉病害的首選措施。近年來，利用拮抗微生物被認(rèn)為是有效控制植物病害的重要途徑[5]。多種生防菌，如木霉(Trichodermaspp.)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、磚紅微桿菌(Microbacteriumtestaceum)、多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)以及蒼白桿菌(Ochrobactrumsp.)[6-11]等對(duì)霜霉病有抑制作用。作者在霜霉病害生物防治研究中篩選到1 株可有效防治葡萄和黃瓜霜霉病的生防菌株，經(jīng)鑒定為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)，命名為BCJB01，菌種保存號(hào)為CGMCCNO.10477(已申請(qǐng)專利)。為提高霜霉病高效生防菌株BCJB01的發(fā)酵水平，本文以玉米粉和豆粕粉為主要原料，通過正交試驗(yàn)對(duì)BCJB01菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了初級(jí)優(yōu)化，將初級(jí)優(yōu)化出的培養(yǎng)基組合添加酵母提取物進(jìn)行綜合優(yōu)選，并流加糖分，提高生防菌的發(fā)酵水平，以期為其工業(yè)化生產(chǎn)及推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1供試菌株

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus) BCJB01菌株，系本試驗(yàn)室保存菌種，菌種保存號(hào)CGMCCNO.10477。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1普通培養(yǎng)基

蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉1%，pH =7.2；固體培養(yǎng)基添加0.8%的瓊脂，以上均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

正交試驗(yàn)：以玉米粉和豆粕粉為主要原料，輔以四水氯化錳、十二水磷酸氫二鈉、二水磷酸二氫鈉、七水硫酸鎂及氯化鈣，共7個(gè)因素，分別設(shè)置3種不同的水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)條件優(yōu)化，正交試驗(yàn)采用L18(37)設(shè)計(jì)(表1)。

培養(yǎng)基綜合優(yōu)化：在正交優(yōu)選的培養(yǎng)基配方中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.30%酵母提取物，并將其在160、180和200 r /min的轉(zhuǎn)速條件下進(jìn)行綜合比較。

糖分流加試驗(yàn)：以綜合優(yōu)選培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件為基礎(chǔ)，分別測(cè)定在接種時(shí)及接種后6、12和24 h流加糖不同接種時(shí)間對(duì)BCJB01菌體數(shù)量的影響。

表1　發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)(%)

1.3培養(yǎng)方法

將斜面活化的BCJB01菌株接種到50 mL 普通培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)10 h 后，以3%(V/V)的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中(空氣液體比為10∶1)，160、180和200 r /min，30 ℃搖瓶振蕩培養(yǎng)，至48 h或66 h停止培養(yǎng)。

1.4菌體及芽孢測(cè)定方法

菌體數(shù)量采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每處理重復(fù)測(cè)定3次。芽孢形成率用結(jié)晶紫染液染色后于顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，正交優(yōu)選配方為A2B1C2D3E2F3G2，即質(zhì)量分?jǐn)?shù)為玉米粉2.00%、豆粕粉1.00%、二水磷酸二氫鈉0.15%、十二水磷酸氫二鈉0.30%、氯化鈣0.10%、七水硫酸鎂0.035%和四水氯化錳0.003 0%。

表2　正交試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2培養(yǎng)基綜合優(yōu)選

培養(yǎng)基綜合優(yōu)選試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，不同轉(zhuǎn)速條件下，添加酵母提取物的P2配方發(fā)酵液菌體數(shù)量均有提高。其中轉(zhuǎn)速為180 r /min的情況下，P2配方發(fā)酵液菌體數(shù)量最高，為52.60 ×108cfu/mL，是P1配方的1.52倍。同時(shí)，芽孢率為92%。表明添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.30%的酵母提取物可有效提高發(fā)酵液菌體數(shù)量，轉(zhuǎn)速為180 r /min的培養(yǎng)條件有利于BCJB01產(chǎn)生芽孢。

表3　培養(yǎng)基綜合優(yōu)選試驗(yàn)結(jié)果

2.3流加糖對(duì)BCJB01菌體數(shù)量及芽孢形成的影響

以綜合優(yōu)選培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件為基礎(chǔ)，分別測(cè)定流加糖不同接種時(shí)間對(duì)BCJB01菌體數(shù)量的影響。流加糖對(duì)BCJB01菌體數(shù)量的影響結(jié)果見表4。由表4可知，在接菌后6～24 h流加糖均能提高BCJB01菌體數(shù)量，其中接菌后6 h流加糖菌體數(shù)量增加最多，是未流加糖配方的1.95倍。結(jié)合芽孢形成率來看，接菌后6～12 h流加糖有利于BCJB01菌體數(shù)量的增加，對(duì)芽孢的形成與脫落影響不大。

表4　流加糖對(duì)BCJB01菌體數(shù)量及芽孢脫落的影響

3　討論

近年來，蠟樣芽孢桿菌作為生防菌已有一些研究報(bào)道，研究人員發(fā)現(xiàn)其對(duì)黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、番茄灰霉病(Botrytiscinerea)、竹白紋羽病(Rosellinianecatrix)、松材線蟲病(Bursaphelenchusspp.)、小麥全蝕病(Gaeumannomycesgraminisvar．tritici(Ggt))和紋枯病(Rhizoctoniacerealis)均有抑制作用[12-17]，但用于防治霜霉病的研究還鮮見報(bào)道。徐遲默等[18]2015年報(bào)道，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)通過分泌抗生素對(duì)荔枝霜霉病(Peronophytholitchii)產(chǎn)生抑制。本研究中的蠟樣芽孢桿菌BCJB01對(duì)霜霉病的抑制機(jī)理與其不同，它具有降解霜霉病游動(dòng)孢子的作用，直接切斷了病原菌的有效傳染源(未發(fā)表資料)。因此，蠟樣芽孢桿菌BCJB01具有良好的生防應(yīng)用價(jià)值。

生防菌株的發(fā)酵水平是其應(yīng)用的基礎(chǔ)。在實(shí)際生產(chǎn)中，芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基配方通常有玉米粉、葡萄糖、豆餅粉、魚粉以及其他一些微量元素[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵培養(yǎng)基的成分及配比，對(duì)BCJB01發(fā)酵后菌體含量有很大的影響。其中，添加酵母提取物及發(fā)酵過程中流加糖均可顯著提高BCJB01發(fā)酵液的菌體數(shù)量，添加酵母提取物是不添加的1.52倍，流加糖是未流加糖的1.95倍。最終篩選出BCJB01的培養(yǎng)基配方的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為：玉米粉2.00%，豆粕粉1.00%，四水氯化錳0.003 0%，十二水磷酸氫二鈉0.30%，二水磷酸二氫鈉0.15%，七水硫酸鎂0.035%，酵母提取物0.30%和氯化鈣0.10%，同時(shí)在接菌后6～12 h流加0.2%糖，菌體數(shù)量達(dá)100×108cfu/mL以上。

有效活菌數(shù)是衡量微生物菌劑品質(zhì)的重要指標(biāo)[20]，芽孢是有效活菌數(shù)的重要組成部分，抗逆性強(qiáng)，可耐受多種環(huán)境傷害，是制備微生物菌劑的理想形態(tài)。霜霉病高效生防菌株BCJB01若要實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化既要考慮菌體數(shù)量，還要考慮芽孢生成率。本文發(fā)現(xiàn)流加糖能提高BCJB01的菌體數(shù)量，但卻影響它的芽孢形成率，流加糖的時(shí)間十分關(guān)鍵，接菌后6～12 h流加糖既有利于BCJB01菌體數(shù)量的增加，又對(duì)芽孢脫落影響不大，芽孢形成率接近90%。

霜霉病高效生防菌株BCJB01優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方，發(fā)酵液菌體數(shù)量較優(yōu)化前有了顯著提高，菌體數(shù)量達(dá)100×108cfu/mL以上。本研究是在實(shí)驗(yàn)室搖瓶發(fā)酵條件下進(jìn)行的，若要實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，還需在發(fā)酵罐條件下進(jìn)行發(fā)酵及后處理工藝參數(shù)的優(yōu)化試驗(yàn)，同時(shí)要進(jìn)行相關(guān)劑型的研究開發(fā)，后續(xù)工作正在進(jìn)行中。

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DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2016.04.007

收稿日期：2016-04-27

基金項(xiàng)目：山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2015GNC113002)；山東省科學(xué)院-棗莊市產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)聯(lián)合基金(201503)；公益性行業(yè)( 農(nóng)業(yè)) 科研專項(xiàng)(201203035)

作者簡(jiǎn)介：王貽蓮(1978-)，女，副研究員，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物。Email：yilianwang@ 163.com *通信作者。 Email：yewu2@sdas.org

中圖分類號(hào)：Q939.95

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-4026(2016)04-0030-05

Optimization of fermentative medium for highly effective biocontrol strainBacilluscereusBCJB01 against downy mildew

WANG Yi-lian,XIE Xue-ying,HU Jin-dong,CHEN Kai,YANG He-Tong,LI Ji-shun*

(Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology, Biology Institute, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China)

Abstract∶To improve fermentation level of Bacillus cereus BCJB01, a highly efficient biocontrol strain against downy mildew, we optimized its fermentative medium through orthogonal test, comprehensive optimization and sugar feeding tests. Mass fraction of the optimized medium formula are 2.00% corn meal,1.00% soybean powder, 0.0030% manganese chloride tetrahydrate, 0.30% twelve aqueous disodium hydrogen phosphate, 0.15% sodium dihydrogen phosphate dihydrate, 0.035% magnesium sulfate heptahydrate, 0.10% calcium chloride, 0.30% yeast extract, 0.2%sugar added at 6～12 h after inoculation. It can produce more than 100×108 cfu/mL cells and its spore rate is 90%, when the cultivation conditions are 3%(V/V) inoculum size, 180 r / min rotation velocity, 30 ℃ shaky cultivation till 66 hours.

Key words∶Bacillus cereus;downy mildew;fermentative medium;orthogonal design; comprehensive optimization