林莎莎，周洪雷*，孫筱林，池雨鋒，蔣海強(qiáng)，張玲，楚新紅

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.三株醫(yī)藥生物研究所，山東 濟(jì)南 250100)

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HPLC測(cè)定經(jīng)不同益生菌發(fā)酵前后黃芪中黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ的含量

林莎莎1，周洪雷1*，孫筱林2，池雨鋒1，蔣海強(qiáng)1，張玲1，楚新紅2

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.三株醫(yī)藥生物研究所，山東 濟(jì)南 250100)

摘要：采用HPLC-ELSD法測(cè)定黃芪經(jīng)不同益生菌株發(fā)酵前后的黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ的含量變化。色譜柱為Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm),采用乙腈-水為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為：1 mL/min。結(jié)果表明，黃芪對(duì)照中黃芪甲苷和皂苷Ⅱ的含量分別為0.476 2 mg/g和0.050 3 mg/g。用混合菌種發(fā)酵后黃芪甲苷和皂苷Ⅱ的含量分別為0.257 8 mg?g和0.109 4 mg?g。黃芪經(jīng)益生菌發(fā)酵后黃芪甲苷含量降低而皂苷Ⅱ的含量升高，且不同菌種發(fā)酵后的黃芪甲苷和皂苷Ⅱ的含量也有差異。

關(guān)鍵詞：黃芪;益生菌發(fā)酵;HPLC-ELSD;黃芪甲苷;黃芪皂苷Ⅱ

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根[1]。黃芪的主要化學(xué)成分有皂苷、黃酮和多糖等。藥理研究表明，大劑量的黃芪總皂苷有強(qiáng)心苷樣的作用，還能夠降低老年大鼠全血比粘度、血漿比粘度以及紅細(xì)胞壓積[2],發(fā)揮明顯抗血栓的作用[3]。其中黃芪甲苷有明顯的正性肌力作用，能改善心臟收縮和舒張的功能[4]。還有研究發(fā)現(xiàn)，黃芪皂苷Ⅱ?qū)θ烁伟┒嗨幠退幖?xì)胞BEL-7402/FU有逆轉(zhuǎn)耐藥作用[5]。

發(fā)酵是傳統(tǒng)中藥加工炮制的重要方法。微生物發(fā)酵能增強(qiáng)中藥的藥效，具有改變藥效物質(zhì)、減毒增效等作用[6]，目前微生物發(fā)酵技術(shù)已經(jīng)成為中藥現(xiàn)代化研究的重要內(nèi)容。本文采用不同益生菌株對(duì)黃芪進(jìn)行發(fā)酵，采用HPLC方法對(duì)黃芪甲苷和皂苷Ⅱ進(jìn)行了含量測(cè)定，為黃芪的臨床用藥及發(fā)酵中藥的研究提供了科學(xué)的依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1儀器

Waters e2695高效液相色譜儀,Waters 2424 ELSD Detector(美國(guó)Waters)；ES-J120電子分析天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；HH恒溫水浴鍋(江蘇金壇市中大儀器廠)；OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)朗儀器有限公司);KQ5200DB型超聲波清洗器( 昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥

黃芪(批號(hào)1504134111，購(gòu)自安國(guó)市祁澳中藥飲片有限公司)。黃芪液及黃芪發(fā)酵液(濟(jì)南三株集團(tuán)醫(yī)藥生物研究所)。對(duì)照品黃芪皂苷Ⅱ(H-037-130428)、黃芪甲苷(H-013-150626)，純度均大于98%(成都瑞芬思生物科技有限公司)。乙腈為色譜純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

Waters e2695 HPLC；Waters 2424 ELSD Detector；Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫，見(jiàn)表1；進(jìn)樣量33 μL，流速為1.0 mLmin；檢測(cè)器條件：漂移管溫度為60 ℃，增益10，氣壓為25 Psi(1 Psi=6 895 Pa)，霧化器為加熱，動(dòng)力水平為60%。

表1　黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ的梯度洗脫條件

2.2對(duì)照品溶液的制備

精密稱定干燥至恒重的黃芪甲苷4.20 mg，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，配成濃度為0.42 mgmL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密稱定干燥至恒重的黃芪皂苷Ⅱ?qū)φ掌?.86 mg，甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，配成濃度為0.786 mgmL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密量取黃芪甲苷對(duì)照品溶液2 mL和黃芪皂苷Ⅱ?qū)φ掌啡芤? mL定容于10 mL容量瓶中配成黃芪甲苷對(duì)照品溶液0.084 mgmL，黃芪皂苷Ⅱ?qū)φ掌啡芤?.078 6 mgmL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3黃芪發(fā)酵液的制備

黃芪粉碎，過(guò)10目篩，取120 g，分成4份，加11.5倍量的水，浸泡，調(diào)pH中性，121 ℃滅菌60 min，冷卻后接種預(yù)培養(yǎng)的益生菌，37 ℃發(fā)酵，期間調(diào)控pH，繼續(xù)發(fā)酵至96 h。結(jié)束發(fā)酵后，加熱煮沸，離心，離心液定容至1 200 mL，115 ℃滅菌50 min備用。黃芪對(duì)照液的制備過(guò)程同上，但不接種益生菌。

表2發(fā)酵黃芪樣品說(shuō)明

2.4供試品溶液的制備

精密量取各黃芪發(fā)酵液20 mL(相當(dāng)于黃芪藥材2 g)，用水飽和正丁醇萃取4次，每次20 mL，合并正丁醇層，蒸干，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，即得供試品溶液。

2.5線性關(guān)系的考察

取黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ的混合對(duì)照品溶液,分別進(jìn)樣3、5、10、15、20、25、30 μL，按2.1色譜條件測(cè)定，記錄峰面積的積分值。以進(jìn)樣量(μg)的常用對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，峰面積的積分值的常用對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，測(cè)得線性方程。黃芪甲苷：Y=1.284 9X+6.985 3，R=0.999 6，線性范圍為0.252 0～2.520 μg；黃芪皂苷Ⅱ：Y=1.383 2X+6.869，R=0.999 6，線性范圍為0.235 8～2.358 μg。

2.6精密度實(shí)驗(yàn)

吸取黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ混合對(duì)照品溶液15 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得黃芪甲苷峰面積的RSD為0.64%，黃芪皂苷Ⅱ峰面積的RSD為0.57%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取黃芪液，精密量取5份，每份10 mL，按照2.4項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，分別制備供試品液，按2.1項(xiàng)的色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ的含量的RSD分別為2.0%和1.9%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液，室溫放置，分別在0、2、6、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明黃芪甲苷峰面積RSD值為1.4%，黃芪皂苷Ⅱ峰面積的RSD為1.5%，表明樣品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密量取混合菌發(fā)酵黃芪液6份，每份10 mL(相當(dāng)于1 g黃芪藥材)，分別精密加入黃芪甲苷對(duì)照品0.252 0 mg，黃芪皂苷Ⅱ?qū)φ掌?.110 0 mg。按照2.4項(xiàng)要求制備供試品溶液。按照2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，得到黃芪甲苷的回收率為99.69%，RSD為2.0%，黃芪皂苷Ⅱ的回收率為100.42%，RSD為2.3%。

2.10樣品的含量測(cè)定

精密量取各黃芪發(fā)酵液20 mL按照2.4項(xiàng)要求制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，計(jì)算黃芪液中的黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ的含量(折合成每克藥材的含量)。結(jié)果見(jiàn)表3，色譜圖見(jiàn)圖1。

表3　黃芪發(fā)酵前后黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ的含量測(cè)定結(jié)果

1號(hào)峰為黃芪甲苷　　2號(hào)峰為黃芪皂苷Ⅱ圖1　HPLC圖Fig.1　HPLC map

3　討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪液中黃芪甲苷的含量為0.476 2 mgg，黃芪經(jīng)過(guò)各種益生菌發(fā)酵后黃芪甲苷的含量明顯降低，其中混合菌發(fā)酵黃芪液中黃芪甲苷的含量最低為0.257 8 mgg，含量降低了45.86%。黃芪對(duì)照液中黃芪皂苷Ⅱ的測(cè)得含量為0.050 3 mgg，黃芪經(jīng)短雙歧桿菌和混合菌發(fā)酵后黃芪皂苷Ⅱ的含量分別為0.106 4 mgg和0.109 4 mgg，黃芪皂苷Ⅱ的含量分別增加了52.73%和54.02%。

不同的益生菌發(fā)酵的結(jié)果不同[7]。短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌以及混合菌種有各自的生物轉(zhuǎn)化機(jī)制，這些機(jī)制可能為:發(fā)酵菌種以黃芪甲苷或者一些非有效成分為前體進(jìn)行代謝或轉(zhuǎn)化成新的活性成分，從而使黃芪甲苷含量降低；不同的益生菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的初生代謝產(chǎn)物、次生代謝產(chǎn)物與黃芪甲苷或者黃芪藥材中的某些物質(zhì)產(chǎn)生了化學(xué)反應(yīng)，生成了新的物質(zhì)；黃芪中的某些物質(zhì)可能對(duì)不同益生菌的生長(zhǎng)或代謝產(chǎn)生促進(jìn)或抑制作用，且對(duì)不同益生菌的促進(jìn)或抑制的程度不同，從而改變了黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ，以及其他活性成分的比例[8]。

微生物發(fā)酵不僅改變了中藥的活性成分，進(jìn)而也改變了中藥的臨床療效，使中藥能在外觀和口感上更好地被病人接受，該技術(shù)為中藥的開(kāi)發(fā)與利用提供了新的思路和方法。本文采用HPLC-ELSD法，以乙腈-水作為流動(dòng)相，對(duì)發(fā)酵前后的黃芪中的黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ進(jìn)行含量測(cè)定，靈敏度高、分離度好、操作處理簡(jiǎn)單且重現(xiàn)性好，回收率高，是一種良好的黃芪甲苷和黃芪皂苷Ⅱ的測(cè)定方法。

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DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2016.04.004

收稿日期：2015-12-28

基金項(xiàng)目：山東省科技計(jì)劃(2013GSF11903);山東省自然科學(xué)基金(ZR2015HM080);山東省高校中醫(yī)藥抗病毒協(xié)同創(chuàng)新課題(XTCX2014C01-03)

作者簡(jiǎn)介：林莎莎(1990-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幖疤烊凰幬镉行С煞旨百|(zhì)量控制。Email：786429573@qq.com *通信作者,周洪雷(1967-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幖疤烊凰幬镉行С煞旨百|(zhì)量控制。Email：zhouhongleitcm@163.com

中圖分類號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-4026(2016)04-0017-04

HPLC based content determination of AstragalosideⅥ and Ⅱ in various probiotics fermented Radix Astragali

LIN Sha-sha1, ZHOU Hong-lei1*, SUN Xiao-lin2,CHI Yu-feng1,JIANG Hai-qiang1, ZHANG Ling1,CHU Xin-hong2

(1. School of Pharmacy,Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;2. Medical Institute of San Zhu Co., Jinan 250100, China)

Abstract∶We determined content variation of AstragalosideⅥ and AstragalosideⅡ in various probiotics fermented Radix Astragali with HPLC-ELSD. Determination conditions were chromatographic column of Agilent C18 column (250 mm×4.6 mm,5 μm),mobile phase of acetonitrile and water mixture, a linear gradient elution, 1 mL/min flow rate. The contents of AstragalosideⅥ and AstragalosideⅡ in Radix Astragali were 0.476 2 mg/g and 0.050 3 mg/g. After fermentation with mixed probiotics, the contents of AstragalosideⅥ and AstragalosideⅡ were 0.257 8 mg/g and 0.109 4 mg/g.Results show that the content of AstragalosideⅡ increases through probiotics fermentation,but the content of AstragalosideⅥ decreases. Moreover, the contents of AstragalosideⅥ and AstragalosideⅡare different through various probiotics fermentation.

Key words∶Radix Astragali; probiotic fermentation; HPLC-ELSD;AstragalosideⅥ;Astragaloside Ⅱ

【中藥與天然活性產(chǎn)物】