郭子龍,王艷偉,楊光參

(溫州大學(xué)物理與電子信息工程學(xué)院，浙江 溫州 325035)

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鐵離子引起的DNA電荷逆轉(zhuǎn)和凝聚

郭子龍,王艷偉*,楊光參*

(溫州大學(xué)物理與電子信息工程學(xué)院，浙江 溫州 325035)

摘要：在生物體中，DNA會(huì)凝聚成緊密結(jié)構(gòu)，對(duì)于遺傳信息的儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)錄有重要意義。對(duì)于DNA的凝聚以及伴隨的電荷逆轉(zhuǎn)已經(jīng)有了比較深入的研究，這些研究大多集中于一些水解性較弱的離子，而對(duì)于那些易水解對(duì)于溶液pH影響較大的金屬離子(例如鐵離子)的研究較少。本文系統(tǒng)地研究了鐵離子引起的DNA電荷逆轉(zhuǎn)和凝聚，通過與DNA在三氯六氨絡(luò)合鈷凝聚的對(duì)比，探索了鐵離子引起的DNA的電荷逆轉(zhuǎn)和凝聚的可能機(jī)制。

關(guān)鍵詞：鐵離子；DNA；電荷逆轉(zhuǎn)；凝聚

DNA作為一種重要的生物大分子，在體液環(huán)境中帶有較高的負(fù)電荷，并且被溶液中的帶有正電的平衡離子所包圍著。在DNA參與的生理過程中，平衡離子與DNA之間的相互作用發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。例如:在真核細(xì)胞內(nèi)，帶有大量正電的組蛋白會(huì)使DNA發(fā)生凝聚，并且組蛋白作為凝聚核；當(dāng)這個(gè)凝聚體系周圍的鹽溶液的濃度升高時(shí)，凝聚會(huì)受到抑制，形成相對(duì)松散的凝聚結(jié)構(gòu)[1-2]。帶電聚電解質(zhì)(例如DNA和蛋白質(zhì))與溶液中多價(jià)平衡離子作用會(huì)導(dǎo)致兩種相互伴隨的現(xiàn)象：凝聚和電荷逆轉(zhuǎn)。對(duì)于DNA的電荷逆轉(zhuǎn)和凝聚現(xiàn)象的深入研究不僅詮釋了DNA如何參與生理過程，并且各種凝聚劑對(duì)于DNA的電荷逆轉(zhuǎn)作用在基因轉(zhuǎn)染過程中也已經(jīng)有了廣泛的應(yīng)用[3]。

DNA的電荷逆轉(zhuǎn)指的是，帶負(fù)電DNA吸附溶液中的帶有異種電荷的平衡離子，平衡離子的價(jià)態(tài)達(dá)到三價(jià)以上，便可能會(huì)使大分子表面帶有的凈電荷的電性發(fā)生變化[4]。在正價(jià)離子的作用下，DNA本身的形貌也會(huì)發(fā)生變化，帶有負(fù)電的基因片段之間會(huì)相互吸引，線型的DNA會(huì)凝聚成球形、桿狀或是“面包圈”等形狀[5-6]。這兩種現(xiàn)象是相互伴隨出現(xiàn)的，當(dāng)DNA的表面的電荷被平衡離子中和為0 的時(shí)候，相應(yīng)的測(cè)量的DNA的凝聚力應(yīng)該是最大的[7]。最近幾十年，相當(dāng)多的實(shí)驗(yàn)研究了DNA的電荷逆轉(zhuǎn)，所使用的手段包括動(dòng)態(tài)光散射(dynamiclightscattering,DLS)、熒光電泳(fluorescentmicroscopyandsinglemoleculeelectrophoresis)和原子力顯微鏡(atomicforcemicroscopy,AFM)。動(dòng)態(tài)光散射和熒光電泳主要測(cè)量溶液中大分子的電泳遷移率和Zeta電位情況，從而確定DNA表面的凈電荷量。Luan等[8]的研究指出，電泳遷移率的逆轉(zhuǎn)是可以充分說明DNA表面電荷逆轉(zhuǎn)的。被廣泛接受的結(jié)論是三價(jià)以及高于三價(jià)的平衡離子可以引起凝聚現(xiàn)象，但是并沒有確定的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表明三價(jià)離子可以引起電荷逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。

我們?cè)敿?xì)地研究了不同濃度的鐵離子溶液中的DNA的電泳遷移率，以及在相應(yīng)濃度下的DNA的凝聚現(xiàn)象，并且與三氯六氨合鈷的溶液中的DNA電泳遷移和凝聚做了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)鐵離子引起的DNA的凝聚和電荷逆轉(zhuǎn)，除了鐵離子的價(jià)態(tài)，溶液的pH也是重要的影響因素。

1　原理

常用于研究DNA凝聚和電荷逆轉(zhuǎn)的凝聚劑包括三氯六氨合鈷、精胺(spermine)和亞精胺(spermidine)[9]。之前對(duì)于DNA的電荷逆轉(zhuǎn)的研究主要使用的是一些水解較弱的離子，例如 [Ru(NH3)6]3+和[Fe(CN)6]3+等正價(jià)離子的絡(luò)合物或是聚胺類物質(zhì)[10]。二價(jià)的鎂離子本身不會(huì)引起DNA的凝聚，但向溶液中加入高分子(聚乙二醇)也會(huì)使DNA發(fā)生凝聚[11]。當(dāng)引起DNA凝聚的離子是兩性離子的時(shí)候，溶液pH會(huì)對(duì)于凝聚產(chǎn)生較大的影響[12]。即使是精胺、亞精胺這類酸度系數(shù)(pKa)值較高的離子在作為凝聚劑時(shí)，溶液pH的升高也會(huì)抑制DNA的凝聚[13]。在不同pH的水溶液中，鐵離子存在如下的水解過程：

(1)

這種水解過程一方面降低了溶液中鐵離子的有效電荷，另一方面溶液中的氫離子的濃度會(huì)有所升高，會(huì)抑制以上的水解過程。水解過程中，溶液的pH會(huì)下降。當(dāng)溶液的pH低于DNA的等電點(diǎn)時(shí)，DNA的溶解度會(huì)下降，也伴隨著變性的發(fā)生。另一方面，溶液的pH也影響著鐵離子在水溶液中的價(jià)態(tài)，鐵離子的pK0=2.2，pK1=3.5，pK2=6.0。研究表明，在較低的溶液pH環(huán)境中的整條DNA趨于變性[14]。由于堿基對(duì)的暴露，堿基對(duì)會(huì)在較低pH的溶液中帶有正電荷(DNA的等電點(diǎn)在4到4.5之間)。在這種情況下，DNA是否會(huì)正常的電荷逆轉(zhuǎn)或者凝聚很少有相關(guān)研究涉及，這類實(shí)驗(yàn)在理論解釋中也存在一定空白，現(xiàn)有的解釋DNA電荷逆轉(zhuǎn)或是凝聚的理論[15](Manning)都是以DNA作為一個(gè)帶有面電荷密度為-1.44×10-19C/nm2的桿狀模型去研究的，當(dāng)DNA由于溶液pH發(fā)生變化時(shí)帶電量變化或DNA變性時(shí)與平衡離子的相互作用并無相關(guān)理論涉及，所以我們對(duì)于鐵離子引起的DNA的電荷逆轉(zhuǎn)和凝聚的研究有重要的理論和實(shí)踐意義。

2　實(shí)驗(yàn)方法及材料

2.1實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)中使用的氯化鐵、三氯六氨合鈷([Co(NH3)6]3+，cobalthexammol，Cohex)和TRIS(hydroxymethylaminoethane)等藥品都購自Simga公司；使用的DNA統(tǒng)一為λ-phageDNA(48502bp),購自NewEnglandBiolabs；在磁鑷實(shí)驗(yàn)中使用的PBS磷酸緩沖液含有10mmol/L的磷酸根，140mmol/L的鈉離子，pH為8.0。實(shí)驗(yàn)中所有溶液使用去離子水配置，采用Milli-QWaterPurificationSystem(MilliporeCorporation,American)制備純化處理。所有的實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)兩次，以保證其可重復(fù)性。

2.2DNA電泳遷移率的測(cè)量

采用動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量技術(shù)測(cè)量DNA在不同濃度的凝聚劑中的電泳遷移率，使用的設(shè)備為MalvernZetasizernanoZS90。Zeta電位()可以通過對(duì)于電泳遷移率的測(cè)量計(jì)算得到，Zeta電位反映的是帶電大分子在溶液中的粘滯層的帶電量和所帶電荷的電性[16]。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過程中使用了1mmol/L，pH=8.0的TRIS緩沖液，使鐵離子等水解引起的pH變化適當(dāng)減弱，以便我們觀察不同濃度的鐵離子溶液對(duì)于DNA電泳遷移率的影響。鐵離子、鑭離子和三氯六氨合鈷使溶液pH變化程度見表1。

表1　金屬陽離子溶解在1 mmol/L的TRIS緩沖液的pH變化

2.3磁鑷裝置

圖1　磁鑷裝置原理Fig.1　Schematic diagram of magnetic tweezers

凝聚力測(cè)量采用橫向磁鑷設(shè)備如圖1所示，在磁鑷實(shí)驗(yàn)中我們?cè)讦?phageDNA的兩端分別修飾帶有單鏈的12個(gè)堿基對(duì)的寡核苷酸，分別帶有生物素和地高辛(3’biotin-cccgccgctgga和3’digoxygenindig-tccagcggcggg)[17]。在蓋玻片側(cè)壁用砂紙磨光并修飾抗地高辛與DNA帶有地高辛的一端連接，DNA另一端與修飾有鏈親和素的順磁球連接。觀測(cè)順磁球的布朗運(yùn)動(dòng)便可求得對(duì)于DNA施加的拉力[18]。這樣操作相當(dāng)于給DNA一端裝上了可以操作的“手柄”。詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)操作可見實(shí)驗(yàn)小組之前發(fā)表的文章[11，19]。整個(gè)連接系統(tǒng)處于PBS溶液中，為了排除鈉離子對(duì)于實(shí)驗(yàn)的影響，我們?cè)跊_入實(shí)驗(yàn)所用離子之前使用300μL的1mmol/LTRIS緩沖液以10μL/min的速度沖洗實(shí)驗(yàn)用的樣品槽，樣品槽的容量大約是130μL左右。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1DNA電泳遷移率測(cè)量結(jié)果

圖2中比較了不同濃度的鐵離子和Cohex引起的DNA的電泳遷移率的變化。DNA電泳遷移率隨著Cohex濃度的增大而升高，但并不會(huì)發(fā)生電荷逆轉(zhuǎn)。而DNA在鐵離子溶液中時(shí)，隨著鐵離子濃度的升高，DNA的電泳遷移率發(fā)生了明顯的改變。在0.01mmol/L和0.1mmol/L的時(shí)候，DNA在鐵離子溶液中的遷移率遠(yuǎn)低于在鈷離子溶液中。當(dāng)濃度升高到0.5mmol/L以上時(shí)，DNA電泳遷移率明顯升高，并且發(fā)生電荷逆轉(zhuǎn)。

圖2　不同濃度的鈷離子六胺絡(luò)合物和鐵離子對(duì)于DNA電泳遷移率的影響Fig.2　 Impact of different concentrations cobalt hexamine and ferric ion on electrophoretic migration rate of condensed DNA

3.2DNA力譜結(jié)果

圖3a為DNA在PBS緩沖液中，最初施加在DNA上的拉力為5.6pN，每隔2min施加在DNA的拉力減小一次。圖3b為DNA在1mmol/L的Cohex溶液中，以同樣的方式減小對(duì)于DNA的拉力。圖3c為DNA受到的拉力減小的速度更慢，在pH=3水溶液中得到的力譜。圖3d為DNA在1mmol/L，pH=3的Cohex溶液中發(fā)生凝聚，減小力的過程與(c)相同。我們可以發(fā)現(xiàn)相對(duì)無多價(jià)離子的對(duì)照(圖3a)來說，加入Cohex溶液中的DNA在大約700s時(shí)的(圖3b中箭頭所示)長度發(fā)生了突然的減小，此時(shí)作用在DNA上的拉力(4.5pN)我們稱之為凝聚力，凝聚力的大小為DNA的自由能和長度之比。圖3c顯示溶液的pH降到3.0，DNA上施加的拉力慢慢減小時(shí)，DNA并不會(huì)因?yàn)槿芤簆H的降低發(fā)生凝聚；而在圖3d中，DNA處在1mmol/L的Cohex溶液中，pH為3.0，此時(shí)DNA發(fā)生了凝聚，主要由于部分DNA發(fā)生變性，DNA凈電荷量的減少，使DNA剛性受到影響，此時(shí)DNA凝聚不再有圖3b中那樣的臺(tái)階狀的凝聚。已經(jīng)有研究[20]表明，當(dāng)溶液的pH較低時(shí)，常溫下DNA會(huì)發(fā)生變性。

圖3　DNA力譜圖Fig.3　DNA force spectrum

圖4a為DNA在0.1mmol/L的鐵離子溶液中的力譜圖，此時(shí)DNA在鐵離子溶液中并無明顯的凝聚現(xiàn)象。圖4b為DNA在1mmol/L的鐵離子溶液中的力譜圖。圖4c顯示當(dāng)溶液中鐵離子的濃度上升到10mmol/L的時(shí)候，對(duì)DNA的拉力為18.7pN并且在施加的拉力未減小的情況下DNA發(fā)生了凝聚，DNA的長度隨著時(shí)間的推移而變短。此時(shí)溶液的pH為2.35，溶液中的鐵離子水解較弱，大部分應(yīng)該以Fe3+的形式存在。圖4d顯示在10mmol/L的鐵離子溶液中，DNA收縮達(dá)到穩(wěn)定后，我們繼續(xù)減小施加在DNA上的拉力，DNA繼續(xù)凝聚。這主要因?yàn)槿芤旱膒H低于DNA的等電點(diǎn)時(shí)，DNA發(fā)生了變性。圖2中，1mmol/L鐵離子溶液中電泳遷移率為正，表明溶液中DNA的凈電荷為正；但此時(shí)DNA并未發(fā)生凝聚，二價(jià)或三價(jià)離子本身并不能使DNA發(fā)生如此明顯的電荷逆轉(zhuǎn)，說明部分DNA變性，堿基此時(shí)帶有正電荷。這也可以很好地解釋在1mmol/L鐵離子溶液中的，DNA在更大拉力的作用下長度相對(duì)于0.1mmol/L時(shí)更短。此時(shí)溶液中存在兩方面的機(jī)制使DNA發(fā)生凝聚，一方面溶液中的三價(jià)的鐵離子濃度較高，會(huì)使DNA發(fā)生凝聚；另一方面由于溶液的pH較低，使DNA發(fā)生了變性，堿基在溶液較低pH的作用下帶有正電荷提高了電荷補(bǔ)償率，從而使DNA發(fā)生凝聚。

圖4　DNA在鐵離子溶液中的力譜圖Fig.4　Force spectrum of DNA in ferric ion solution

在我們的實(shí)驗(yàn)中，DNA有鐵離子引起的凝聚僅僅發(fā)生在濃度為10mmol/L時(shí)，此時(shí)溶液pH較低，DNA發(fā)生變性，與pH為3.0時(shí)六氨合鈷所引起的DNA凝聚較為相似；與pH為8.0時(shí)，三價(jià)離子引起的DNA凝聚不同，凝聚過程不再帶有臺(tái)階狀的力譜。

4　結(jié)論

DNA在0.1mmol/L的鐵離子溶液中并不會(huì)發(fā)生電荷逆轉(zhuǎn)或凝聚，此時(shí)溶液中鐵離子由于水解主要以Fe(OH)2+的形式存在；當(dāng)鐵離子的濃度提高到1mmol/L時(shí)，由于DNA部分發(fā)生變性且此時(shí)溶液的pH低于等電點(diǎn)，所以可以觀測(cè)到DNA的電荷逆轉(zhuǎn)和初始長度的縮短，并不會(huì)發(fā)生凝聚；當(dāng)鐵離子濃度上升到10mmol/L的時(shí)候，由于此時(shí)溶液中存在三價(jià)Fe3+且pH低于等電點(diǎn)，所以DNA會(huì)發(fā)生明顯的凝聚現(xiàn)象，這種凝聚不僅是與三價(jià)離子引起的電荷補(bǔ)償有關(guān)，DNA的變性也使凝聚的力譜發(fā)生了改變。

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DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2016.04.018

收稿日期：2016-04-19

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(11274245, 10974146, 11304232, 11444006)

作者簡介：郭子龍，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯F(xiàn)象中的凝聚態(tài)物理。 *通信作者，楊光參，Email:yanggc@wzu.edu.cn; 王艷偉，Email:wangyw@wzu.edu.cn

中圖分類號(hào)：Q78

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-4026(2016)04-0093-06

Ferric ion induced DNA charge inversion and condensation

GUO Zi-long, WANG Yan-wei*, YANG Guang-can*

(School of Physics and Electronic Information Engineering, Wenzhou University, Wenzhou 325035, China)

Abstract∶The fact that DNA is condensed into a compact structure in an organism is very important for the storage and transcription of genetic information. Previous intensive studies involve DNA condensation and associated charge inversion. Most of them highlight polyamines and worse hydrolytical ions, but less of them involve easy hydrolytical and pH greatly influenced metallic ion (such as ferric ion). We systematically investigate ferric ion induced DNA charge inversion and condensation.By comparison with cobalt hexamine, we explore a possible mechanism of ferric ion induced DNA charge inversion and condensation.

Key words∶ferric ion;DNA; charge inversion; condensation