張文龍，張培茂，朱月浩，陰文超，高華萍，劉文值

(攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科,四川攀枝花 617000)

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自噬對脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷的影響

張文龍，張培茂，朱月浩，陰文超，高華萍，劉文值

(攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科,四川攀枝花 617000)

目的研究自噬對脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷的影響。方法將48只SD大鼠平均分為4組:(1)生理鹽水對照組(NS組)；(2) 脂多糖(LPS)模型組(L組)；(3)LPS+自噬組(L+A)；(4)LPS+自噬抑制組(L+I)。血氣分析檢測動脈血氧分壓(PaO2)、動脈二氧化碳分壓(PaCO2)和pH值;計算肺組織干濕比；HE染色觀察肺組織病理學(xué)變化并進(jìn)行肺損傷評分;酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清和肺泡灌洗液中微管關(guān)聯(lián)蛋白LC3b、髓過氧化物酶(MPO)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2(MIP-2)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達(dá)。結(jié)果與NS組比較,L組動脈血PaO2、pH值降低，PaCO2升高(P<0.05);與L組相比,L+A組動脈血PaO2、pH值上升,PaCO2下降(P<0.01)；L+I組動脈血PaO2、pH值降低，PaCO2升高(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。L組和L+I組血清和肺泡灌洗液中LC3b水平降低，MPO、MIP-2、IL-1β和TNF-α水平均升高，而L+A組正好相反。結(jié)論自噬對脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷起到改善或保護(hù)作用。

自噬；脂多糖；急性肺損傷；抗炎；肺保護(hù)

急性肺損傷(acute lung in jury,ALI)是由多種炎性介質(zhì)及效應(yīng)細(xì)胞共同參與,多發(fā)病環(huán)節(jié)介導(dǎo)，呈級聯(lián)放大的瀑布樣炎癥，多繼發(fā)彌漫性肺實質(zhì)損傷和多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)[1]。ALI常惡化為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),二者均表現(xiàn)為彌漫性肺泡實質(zhì)損傷和急性、進(jìn)行性呼吸窘迫以及頑固性低氧血癥，本質(zhì)是失控的炎性反應(yīng)。雖對ALI進(jìn)行了大量研究，但病死率仍達(dá)40%～70%，若伴有膿毒癥則更高[2-4]。自噬(autophagy)即細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大分子物質(zhì)(如脂質(zhì)、微生物等)被轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體進(jìn)行水解，包括微自噬(microautophagy)、巨自噬(macroautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)[5-7]。微自噬主要是溶酶體膜直接包裹長壽命蛋白，并在溶酶體內(nèi)降解[8]；巨自噬則由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源的膜包繞待降解物形成自噬體(autophagosome)，再與溶酶體融合而降解其內(nèi)容物[9-10]；CMA胞質(zhì)內(nèi)蛋白結(jié)合分子伴侶后被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體腔，然后被消化為可溶的蛋白質(zhì)分子[11]。在缺氧、應(yīng)激及損傷情況下，自噬亦表現(xiàn)為抗炎和細(xì)胞保護(hù)作用[12-14]。本研究以脂多糖誘導(dǎo)大鼠ALI，探索自噬在ALI中的作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物由攀枝花學(xué)院醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供的健康清潔級雄性SD大鼠48只,體質(zhì)量(250±30)g,2.5～3.0月齡,按隨機(jī)、對照原則分為4組(n=12):即生理鹽水對照組(NS組)；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)模型組(L組)； LPS+自噬組(L+A)；LPS+自噬抑制組(L+I)。

1.2儀器與試劑大腸桿菌內(nèi)毒素LPS(L2880，Sigma)；LC3b、髓過氧化物酶(MPO)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2(MIP-2)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司)；蘇木素染液(碧云天)。MK3 型酶標(biāo)儀(賽默飛儀器有限公司)；德國Effendorf 5810R離心機(jī)；BX40F4型光學(xué)顯微鏡(Olympus，日本)；AxioCam ERC5s 成像系統(tǒng)(德國蔡司)；自動血氣分析儀(Stat Profile pHOx，Nova Biomedical公司,美國)。

1.3實驗方法

1.3.1分組方法采用隨機(jī)數(shù)字法將48只大鼠平均分為4組，各組大鼠分別以10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉(4 mL/kg)，固定大鼠，無菌操作下作頸部正中切口使氣管暴露，按各組要求滴注相關(guān)藥物：(1)NS組：氣管滴注0.9%氯化鈉注射液5 mg；(2)L組：氣管滴注LPS 2.5 mg+0.9%氧化鈉注射液 2.5 mg；(3)L+A組：氣管滴注LPS 2.5 mg+雷帕霉素2.5 mg；(4)L+I組：氣管滴注LPS 2.5 mg+3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)2.5 mg。注入后迅速將動物直立并旋轉(zhuǎn)，使藥液均勻分布在肺中，待大鼠呼吸平穩(wěn)后縫合傷口。注射0.9%氧化鈉注射液、LPS及相關(guān)藥物24 h后，收集標(biāo)本。

1.3.2標(biāo)本采集經(jīng)頸部正中切開皮膚,逐層分離肌肉,暴露氣管，用16號氣管導(dǎo)管進(jìn)行插管，固定后用預(yù)冷的PBS進(jìn)行肺泡灌洗，收集肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)，4 ℃ 1 300 r/min離心10 min，收集上清液，-80 ℃保存。經(jīng)腹部正中切開皮膚,逐層分離肌肉,暴露胸膜；剪破胸膜，打開胸腔，暴露心臟和肺，左心室取血，進(jìn)行血氣分析并離心取上清液4 ℃ 1 800 r/min離心10 min，-80 ℃保存。分離肺組織，取右肺上葉進(jìn)行干濕比檢測，右肺中葉用10%中性多聚甲醛固定行HE染色，冰面上取左肺置液氮中速凍后放入-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4檢測指標(biāo)

1.4.1肺組織干濕比取出右肺上葉,濾紙吸干表面水分,置入一潔凈的小玻璃瓶中,精確稱取濕重(W)后,置75 ℃恒溫烤箱中,烘烤24 h至恒重后測定肺組織干重(D),計算W/D以評估肺組織的水腫程度。

1.4.2蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色取右肺中葉用10%中性甲醛固定24 h后,脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片(厚度4 mm),HE染色。光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化并進(jìn)行病理學(xué)評分。評分標(biāo)準(zhǔn):對肺泡充血(alveolar congestion)、出血(hemorrhage)、肺泡腔或血管壁中性粒細(xì)胞浸潤或聚集(PMN)、肺泡壁增厚和(或)透明膜形成(transparent membrane)4項指標(biāo),分別根據(jù)病變輕重評0～4分。0分:無病變或病變非常輕微；1分:輕度病變；2分:中度病變；3分:重度病變；4分:極重度病變。各項評定分?jǐn)?shù)相加為ALI病理學(xué)總評分。

1.4.3動脈血氣分析測定動脈血氧分壓(PaO2)、動脈二氧化碳分壓(PaCO2)和pH值。

1.4.4血清和BALF微管關(guān)聯(lián)蛋白LC3b、MPO、MIP-2、IL-1β、TNF-α檢測用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定LC3b、MPO、MIP-2、IL-1β和TNF-α的水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

2　結(jié)　　果

2.1各組大鼠肺干濕比與NS組比較，L組大鼠的肺組織干濕比增加；與L組比較，L+A組肺組織干濕比下降，L+I組肺組織干濕比增加(圖1)。

A：各組大鼠肺干濕比比較；B：各組HE染色病理學(xué)評分比較。

圖1大鼠肺干濕比及HE病理染色評分比較

圖2　　肺組織HE染色病理切片

2.2HE染色、ALI病理學(xué)評分比較與NS組比較,L組ALI評分升高(P<0.01)。與L組比較,L+A組ALI評分降低(P<0.05),而L+I組評分較L+A組高(P<0.01)，見圖2。光鏡下見NS組肺泡結(jié)構(gòu)完整，大小均勻，肺泡腔清晰、壁薄，未見肺水腫和炎性細(xì)胞浸潤。L組肺泡腔變窄,肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)有充血、水腫細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤。L+A組肺泡腔輕度擴(kuò)大，肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)少量紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤，輕度充血水腫。L+I組肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔更窄，肺泡間隔明顯增厚，肺間質(zhì)及肺泡充血、水腫、大量炎性細(xì)胞浸潤，且肺泡腔內(nèi)有大量的紅細(xì)胞及滲出物,HE染色結(jié)果見圖2。

2.3動脈血氣分析各組大鼠間的動脈血氣分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中L組和L+I組PaCO2顯著升高、PaO2和pH值降低，可能與肺部損傷較嚴(yán)重有關(guān)；而L+A組大鼠的PaCO2降低、PaO2升高和pH值相對升高，自噬的參與可能緩解了ALI的炎癥和病理改變，起到肺保護(hù)的作用。

2.4大鼠血清和BALF的炎性因子水平通過ELISA試劑盒的檢測，大鼠血清和BALF的LC3b、MPO、MIP-2、IL-1β和TNF-α水平L+I組增加明顯，而L+I組下降。由此可見，L組炎性反應(yīng)最重，L+I組次之，L+A組較輕，NS組則最輕(圖4～6)。

表2　　各組大鼠PaO2、PaCO2、pH值變化比較

圖3　　大鼠動脈血氣分析

A、C:血清；B、D:BALF。

圖4大鼠BALF及血清LC3b、IL-1β表達(dá)

A、C:血清；B、D:BALF。

圖5大鼠BALF及血清TNF-α、MPO的表達(dá)

A:BALF；B：血清。

圖6大鼠BALF及血清MIP-2的表達(dá)

3　討　　論

ALI或ARDS為臨床常見的危重癥，主要引起肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，以肺容積減少、肺順應(yīng)性降低、通氣/血流比例失調(diào)最為常見，導(dǎo)致急性或持續(xù)性呼吸功能不全。在缺氧、應(yīng)激及各種損傷等情況下，細(xì)胞通過自噬維持著細(xì)胞及周邊的內(nèi)環(huán)境和穩(wěn)態(tài)。自噬可能通過相關(guān)的信號通路，如MAPK、NLRP3炎癥小體和核因子(NF)-κB等激活細(xì)胞內(nèi)趨化因子、炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子的釋放，起到調(diào)控炎癥發(fā)生發(fā)展的作用[15-16]。而自噬在細(xì)胞成分更新、保持旺盛的生理狀態(tài)和維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面以及腫瘤、心腦血管、自身免疫和神經(jīng)退化性等疾病中扮演的重要角色已為大家所熟知。在LPS誘導(dǎo)的ALI模型中，主要通過TLR4誘導(dǎo)自噬生成，與受體相關(guān)蛋白-Toll樣受體相關(guān)的干擾素活化，及線粒體活化蛋白激酶p38有密切關(guān)系[7]。由此推測，在各種原因所致的肺損傷中自噬也發(fā)揮重要作用。有研究顯示[17]，自噬在線粒體氧化磷酸化障礙導(dǎo)致的三磷酸腺苷(ATP)合成不足和活性氧聚積導(dǎo)致的肺損傷中也發(fā)揮重要作用，但具體機(jī)制尚不清楚。本研究通過LPS誘導(dǎo)ALI模型的建立，分別經(jīng)氣管給予促進(jìn)大鼠肺泡細(xì)胞自噬作用的雷帕霉素及抑制肺泡細(xì)胞自噬作用的3-甲基腺嘌呤處理。對比發(fā)現(xiàn)，經(jīng)雷帕霉素處理的大鼠肺組織水腫較其他組明顯減輕，干濕比有所下降，肺泡腔輕度擴(kuò)張，炎性細(xì)胞浸潤減弱，肺間質(zhì)充血及水腫等病理評分，較3-甲基腺嘌呤抑制自噬處理后的大鼠肺組織病理評分更低。雷帕霉素屬于新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，主要用于抗真菌的治療，同時它可通過不同的細(xì)胞因子阻斷淋巴細(xì)胞等免疫信號的傳導(dǎo)，從而具備免疫抑制的功能，起到降低機(jī)體炎性反應(yīng)的目的，一定程度上促進(jìn)了自噬的發(fā)生。3-甲基腺嘌呤作為抑制自噬的常規(guī)藥物，已在科研中得到廣泛應(yīng)用。微管關(guān)聯(lián)蛋白LC3b是目前公認(rèn)的自噬分子標(biāo)記抗體，在自噬中扮演重要作用。從4組大鼠BALF及血清ELISA檢測可知，雷帕霉素處理后的LPS模型中LC3b明顯升高，且MPO、IL-1β、TNF-α等炎癥因子表達(dá)均顯著降低(接近于未經(jīng)LPS處理的對照組)。同時，血氣分析提示經(jīng)雷帕霉素處理后的LPS模型組氧分壓更高，二氧化碳分壓接近正常值，對機(jī)體的酸堿內(nèi)環(huán)境影響更小。不難看出，經(jīng)雷帕霉素處理后，大鼠自噬作用增強(qiáng)，對ALI起到明顯的改善或保護(hù)作用，為臨床干預(yù)或治療ALI/ARDS拓展了新的視野。

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Influence of autophagy on rat acute lung injury induced by lipopolysaccharide

ZhangWenlong,ZhangPeimao,ZhuYuehao,YinWenchao,GaoHuaping,LiuWenzhi

(DepartmentofAnesthesiology，AafiliatedHospitalofPanzhihuaUniversity,Panzhihua,Sichuan617000,China)

ObjectiveTo explore the influence of autophagy on lipopolysaccharide(LPS) induced acute lung injury(ALI).Methods Forty-eight Sprague Dawley (SD) rats were randomly divided into four groups,12 cases in each group: (1)normal saline control group (NS),(2)LPS model group (L),(3) LPS and autophagy group (L +A) and (4) LPS and autophagy inhibition group (L+I).Arterial blood samples was obtained for detecting the blood gas,including PaO2,PaCO2and pH,and the lung tissue dry/wet ratio was calculated.The HE staining was used to observe the histopathological changes of lung tissue.Moreover the lung lesion score was performed;the expression of microtubule associated protein,light chain protein 3b(LC3b),myeloperoxidase(MPO),macrophage inflammatory protein 2(MIP-2),interleukin-1β(IL-1β) and tumor necrosis factor-α(TNF-α) in serum and bronchoalveolar lavage fluid(BALF) was assessed by ELISA.ResultsCompared with the NS group,arterial blood PaO2and pH in the group L were decreased and PaCO2was increased (P<0.05);compared with the L group,the arterial blood PaO2and pH in the L+A group were increased and PaCO2was declined (P<0.01),the arterial blood PaO2and pH in the L+I group were decreased and PaCO2was elevated,the differences were statistically significant(P<0.01).The LC3b concentration in serum and BALF in the L group and L+I group was declined,while MPO,MIP-2,IL-1β and TNF-α concentrations were increased,while which in the L+A group were just the opposite.ConclusionAutophagy plays a improvement and protective effect on LPS induced acute lung injure in rat.

autophagy;lipopolysaccharide;acute lung injury;anti-inflammation;lung protection

張文龍(1981-)，主治醫(yī)師，本科，主要從事臨床麻醉、疼痛方面的研究。

R563

A

1671-8348(2016)20-2756-04

2015-12-21

2016-03-05)

論著·基礎(chǔ)研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.20.006