秦曉華，陳艷霞，涂衛(wèi)平，黃　翀，房向東，鄒宏昌，徐承云

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科　330006)

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全反式維甲酸對(duì)高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響及其可能機(jī)制

秦曉華，陳艷霞，涂衛(wèi)平△，黃翀，房向東，鄒宏昌，徐承云

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科330006)

目的探討全反式維甲酸(ATRA)對(duì)高糖環(huán)境下正常人腎小管上皮HK-2細(xì)胞株轉(zhuǎn)分化的影響及其可能機(jī)制。方法將體外培養(yǎng)的HK-2 細(xì)胞按隨機(jī)數(shù)字表法分為以下7組：空白組、高糖組、高滲組、高糖+低濃度ATRA組、高糖+中濃度ATRA組、高糖+高濃度ATRA組、Rho激酶抑制劑Y27632干預(yù)組。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)各組細(xì)胞 RhoA及ROCK1 mRNA表達(dá)水平，采用細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA) 及E-鈣黏蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果RT-PCR結(jié)果顯示：空白組與高滲組RhoA及ROCK1 mRNA表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高糖組RhoA及ROCK1 mRNA表達(dá)水平較空白組、高滲組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；予以ATRA或Y27632干預(yù)后，RhoA及ROCK1 mRNA表達(dá)較高糖組減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且呈現(xiàn)ATRA濃度依賴性。相關(guān)性分析示，高糖組及各ATRA干預(yù)組RhoA mRNA與ROCK1 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.05)。細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示：空白組與高滲組α-SMA及E-鈣黏蛋白表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高糖組α-SMA表達(dá)水平較空白組高，E-鈣黏蛋白表達(dá)水平較空白組低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；予以ATRA或Y27632干預(yù)后，α-SMA表達(dá)明顯減少，E-鈣黏蛋白表達(dá)明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論ATRA可部分逆轉(zhuǎn)高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過程，其機(jī)制可能與抑制RhoA/ROCK信號(hào)通路有關(guān)。

全反式維甲酸；腎小管上皮細(xì)胞；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白；E-鈣黏蛋白；RhoA/Rho激酶信號(hào)通路

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥之一，其主要特點(diǎn)是蛋白尿并伴有腎小球?yàn)V過率下降。全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)是維生素A的活性代謝產(chǎn)物，在機(jī)體中能誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及凋亡，同時(shí)其在基因調(diào)節(jié)方面也起著重要作用[1]。最近研究報(bào)道，ATRA由于能減少轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的表達(dá)，抑制單核細(xì)胞趨化肽1的上調(diào)，被認(rèn)為具有緩解腎損傷，保護(hù)腎臟的作用[2]。然而，其具體作用機(jī)制仍在探索之中。本試驗(yàn)以人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)為研究對(duì)象，探索ATRA對(duì)RhoA/Rho激酶(ROCK)信號(hào)通路的影響，進(jìn)一步探索其保護(hù)腎臟的可能機(jī)制，為臨床治療DN提供新思路。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞來源人腎小管上皮細(xì)胞株(HK-2細(xì)胞株)購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。

1.2儀器與試劑ATRA、Rho激酶抑制劑Y27632、D-葡萄糖、甘露醇(美國Sigma公司)； DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)/F12培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；胎牛血清(BSA)、0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)；Trizol、引物(美國Invitrogen公司)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(北京全式金公司)。核酸微量蛋白測(cè)定儀、PCR擴(kuò)增儀、凝膠圖像成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，DYPC-31DN型電泳儀(北京六一儀器廠)，鼠抗人單克隆α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscleactin，α-SMA)抗體、鼠抗人單克隆E-鈣黏蛋白(epithelial- cadherin，E-cadherin)抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記抗小鼠IgG(北京中杉金橋公司)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)及試驗(yàn)分組HK-2細(xì)胞培養(yǎng)條件：含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待HK-2細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)進(jìn)行傳代，傳代后生長(zhǎng)至約80%融合后改用無血清DMEM/F12繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞按隨機(jī)數(shù)字表法分為以下7組：(1)空白組；(2)高糖組(D-葡萄糖濃度為30 mmol/L)；(3)高滲組(甘露醇濃度為24.5 mmol/L)；(4)高糖+低濃度ATRA組(ATRA濃度為10-7mol/L)、(5)高糖+中濃度ATRA組(ATRA濃度為10-6mol/L )、(6)高糖+高濃度ATRA組(ATRA濃度為10-5mol/L)；(7)Rho激酶抑制劑Y27632干預(yù)組(高糖+Y27632，Y27632濃度為30 μmol/L)，予以高糖培養(yǎng)30 min后再加入Y27632進(jìn)行干預(yù)。各試驗(yàn)組細(xì)胞干預(yù)48 h，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.2RT-PCR檢測(cè)收集各組細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA完整性后測(cè)定RNA濃度。取總RNA 1.5 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，取cDNA 2 μL在2×EasyTaq PCR Super Mix的作用下擴(kuò)增目標(biāo)基因，總反應(yīng)體系50 μL。PCR擴(kuò)增條件： 94 ℃預(yù)變性5 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸7 min，共35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物電泳儀內(nèi)120 V，電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)成像并使用Quantity One軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。RhoA、ROCK1及β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度，見表1。

1.3.3細(xì)胞免疫熒光6孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定20 min(置于4 ℃冰箱)，用0.1% Triton穿孔15 min，5% BSA封閉液室溫封閉30 min后，各孔中滴加鼠抗人單克隆α-SMA 抗體(抗體按1∶200稀釋，5% BSA封閉液配制)或鼠抗人單克隆 E-cadherin抗體4 ℃孵育過夜后取出室溫恢復(fù)30 min，加入FITC標(biāo)記抗小鼠IgG二抗，置37 ℃孵箱孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察。每組細(xì)胞隨機(jī)選取10個(gè)視野攝像，熒光圖片用 Image-Pro Plus 6.0軟件分析，每個(gè)視野積分吸光度值與測(cè)量面積的比值為平均熒光強(qiáng)度(即蛋白相對(duì)表達(dá)量)。

表1　　RhoA、ROCK1及β-actin引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度

2　結(jié)　　果

2.1各組HK-2細(xì)胞RhoA及ROCK1 mRNA表達(dá)水平比較空白組與高滲組RhoA及ROCK1 mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高糖組RhoA及ROCK1 mRNA表達(dá)水平較空白組、高滲組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；予以ATRA或Y27632干預(yù)組RhoA及ROCK1 mRNA表達(dá)水平較高糖組減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且呈現(xiàn)ATRA濃度依賴性。見圖1、表2。

M：蛋白質(zhì)標(biāo)記物；1：空白組；2：高糖組；3：高滲組；4：高糖+低濃度ATRA組；5：高糖+中濃度ATRA組；6：高糖+高濃度ATRA組；7：Y27632干預(yù)組。

圖1各組HK-2細(xì)胞RhoA mRNA及ROCK1mRNA的表達(dá)情況

2.2相關(guān)性分析Pearson直線相關(guān)分析示：高糖組及各ATRA干預(yù)組RhoA mRNA與ROCK1 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.05)。

表2　　各組HK-2細(xì)胞RhoA mRNA及ROCK1 mRNA表達(dá)水平比較

續(xù)表2　　各組HK-2細(xì)胞RhoA mRNA及ROCK1 mRNA表達(dá)水平比較

*：P<0.05，與空白組比較；#：P<0.05，與高糖組比較；△：P<0.05，與高糖+低濃度ATRA組比較；▽：P<0.05，與高糖+中濃度ATRA組比較。

表3　　RhoA mRNA與ROCK1 mRNA的相關(guān)性

2.3各組HK-2細(xì)胞α-SMA及E-cadherin表達(dá)水平比較細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示：空白組與高滲組α-SMA、E-cadherin表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高糖組α-SMA表達(dá)水平較空白組高，E-cadherin表達(dá)水平較空白組低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；予以ATRA或Y27632干預(yù)后，α-SMA表達(dá)明顯減少，E-cadherin表達(dá)明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4　　各組HK-2細(xì)胞α-SMA及E-cadherin表達(dá)水平比較

*：P<0.05，與空白組比較；#：P<0.05，與高糖組比較；△：P<0.05，與高糖+低濃度ATRA組比較；▽：P<0.05，與高糖+中濃度ATRA組比較。

3　討　　論

本研究RT-PCR結(jié)果顯示，各ATRA或Y27632干預(yù)組HK-2細(xì)胞RhoA及ROCK1 mRNA表達(dá)水平均較高糖組降低，呈現(xiàn)ATRA濃度依賴性。且高糖組及各ATRA干預(yù)組RhoA與ROCK1 mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)。這表明高糖可通過RhoA/ROCK信號(hào)通路誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷，而ATRA通過抑制RhoA/ROCK信號(hào)通路能緩解由高糖引起的腎損傷。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，高糖組α-SMA表達(dá)水平較空白組明顯升高，E-cadherin表達(dá)水平較空白組明顯降低，予以ATRA或Y27632干預(yù)后，α-SMA表達(dá)明顯減少，E-cadherin表達(dá)明顯增多。免疫熒光結(jié)果提示，ATRA可通過促進(jìn)HK-2細(xì)胞E-cadherin表達(dá)及減少α-SMA表達(dá)保護(hù)腎臟。

ATRA是維生素A的代謝產(chǎn)物，其通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生參與機(jī)體免疫和炎性反應(yīng)。最近研究表明，ATRA通過上調(diào)LIM同源盒轉(zhuǎn)錄因子1-β(LIM homeobox transcription factor 1-beta，LMX1B)的表達(dá)，下調(diào)TGF-β1、Ⅳ型膠原蛋白和纖維蛋白的表達(dá)，參與因缺氧(復(fù)氧)引起的腎小管上皮細(xì)胞損傷的修復(fù)[3]。Wan等[4]通過將ATRA作用于腎臟細(xì)胞后也發(fā)現(xiàn)，ATRA通過抑制核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號(hào)通路與結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)的表達(dá)，可減少因缺氧導(dǎo)致的腎損傷[4]。Molina-Jijón等[2]在糖尿病腎病(DN)動(dòng)物模型中觀察到，DN腎臟中常伴有ATRA代謝調(diào)節(jié)紊亂，提示ATRA的改變可能是糖尿病腎病發(fā)病起因的新特點(diǎn)。進(jìn)一步研究顯示，ATRA通過減弱氧化應(yīng)激與防止腎臟緊密連接蛋白的丟失參與腎臟的保護(hù)[2]。然而，糖化清蛋白(glycated albumin，GA)在人系膜細(xì)胞中能呈劑量依賴性地增加細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激及COX-2和VCAM-1分子的表達(dá)，ATRA在人系膜細(xì)胞中能將GA的這種作用放大3～4倍，被認(rèn)為是DN新的病理生理特點(diǎn)[5]。

RhoA/ROCK信號(hào)通路是DN導(dǎo)致腎臟纖維化的重要通路之一，其可通過影響轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、血管緊張素Ⅱ、NF-κB的分泌，激活并增強(qiáng)其信號(hào)通路，介導(dǎo)腎臟纖維化[6]。國內(nèi)外關(guān)于ATRA能否通過RhoA/ROCK信號(hào)通路對(duì)腎臟細(xì)胞產(chǎn)生影響的文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究證實(shí)，ATRA可通過抑制RhoA/ROCK信號(hào)通路促進(jìn)E-cadherin表達(dá)及減少α-SMA表達(dá)，緩解因高糖引起的HK-2轉(zhuǎn)分化，參與腎臟保護(hù)，抑制腎臟纖維化。

[1]Zhou TB，Qin YH，Ou C，et al．All-trans retinoic acid can regulate the expressions of gelatinases and apolipoprotein E in glomerulosclerosis rats[J]．Vascul Pharmacol，2011，55(5/6)：169-177.

[2]Molina-Jijón E，Rodríguez-Muoz R，Namorado-Mdel C，et al．All-trans retinoic acid prevents oxidative stress-induced loss of renal tight junction proteins in type-1 diabetic model[J]．J Nutr Biochem，2015，26(5)：441-454.

[3]Zhou TB，Ou C，Jiang ZP，et al．Potential signal pathway between all-trans retinoic acid and LMX1B in hypoxia-induced renal tubular epithelial cell injury[J]．J Recept Signal Transduct Res，2016，36(1)：53-56.

[4]Wan X，Li X，Bo H，et al．All-trans retinoic acid protects renal tubular epithelial cells against hypoxia induced injury in vitro[J]．Transplant Proc，2013，45(2)：497-502．

[5]Alique M，Moreno-Manzano V，Sepúlveda-Muoz JC，et al．All-trans retinoic acid and glycated albumin reciprocally influence their effects in human mesangial cells[J]．Int J Vitam Nutr Res，2005，75(1)：47-53.

[6]Kolavennu V，Zeng L，Peng H，et al．Targeting of RhoA/ROCK signaling ameliorates progression of diabetic nephropathy independent of glucose control[J]．Diabetes，2008，57(3)：714-723.

秦曉華(1976-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事腎臟病的臨床及基礎(chǔ)研究?！?/p>

,E-mail:tuweiping6102@sina.com。

R587.1

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1671-8348(2016)20-2853-03

2016-01-12

2016-03-15)

·經(jīng)驗(yàn)交流·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.20.040