徐紅濤，韓中保,張慧麗，馬林偉

(鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)教研室，江蘇鹽城 224005)

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雷公藤多甙對(duì)A375黑色素瘤生長(zhǎng)、侵襲和血管生成的影響及其機(jī)制

徐紅濤，韓中保,張慧麗，馬林偉

(鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)教研室，江蘇鹽城 224005)

目的探討雷公藤多甙對(duì)黑色素瘤生長(zhǎng)、侵襲和血管生成的影響及其作用機(jī)制。方法采用藥物總評(píng)分(MTS)法考察雷公藤多甙對(duì)人黑色素瘤A375細(xì)胞增殖的影響；利用裸鼠皮下移植瘤模型考察雷公藤多甙對(duì)體內(nèi)黑色素瘤生長(zhǎng)的影響；Transwell實(shí)驗(yàn)考察雷公藤多甙對(duì)人黑色素瘤A375細(xì)胞侵襲的影響；小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)雷公藤多甙對(duì)人黑色素瘤血管生成的影響；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)雷公藤多甙對(duì)A375細(xì)胞分泌因子的影響，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)及白細(xì)胞介素-8(IL-8)等。結(jié)果雷公藤多甙處理A375細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞的體外增殖及體內(nèi)生長(zhǎng)較對(duì)照組明顯受到抑制；腫瘤細(xì)胞的侵襲能力較對(duì)照組明顯減弱；雷公藤多甙能通過下調(diào)VEGF、bFGF及IL-8蛋白從而抑制腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成；但對(duì)TGF-β蛋白的表達(dá)沒有明顯影響。結(jié)論雷公藤多甙具有抗黑色素瘤生長(zhǎng)及侵襲的能力，其機(jī)制可能與抑制黑色素瘤的血管生成有關(guān)。

雷公藤多甙；黑色素瘤；生長(zhǎng)；侵襲；血管生成；分子機(jī)制

雷公藤多甙是由衛(wèi)矛科植物雷公藤根(去皮)經(jīng)粉碎、提取，精制而成[1]。研究發(fā)現(xiàn)雷公藤多甙具有多種藥理學(xué)功能，如抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[2]、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[3]，治療婦科疾病[4]，糖尿病[5]及哮喘[6]等。近年來，諸多研究表明雷公藤多甙具有較為廣泛的抗腫瘤作用[7-8]。本研究以A375黑色素瘤細(xì)胞為研究對(duì)象，考察雷公藤多甙對(duì)黑色素瘤生長(zhǎng)、侵襲及血管生成的影響，并探討其可能的作用機(jī)制，為雷公藤多甙的臨床應(yīng)用提供相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料人源性黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；BALB/c裸鼠(雄性，6～8周齡，18～20 g)，SPF級(jí)，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。雷公藤多甙片購自湖南省醫(yī)藥公司，用DMSO(購自Sigma公司)溶解，并用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后置-20 ℃冰箱中備用。臨用前使用DMEM(購自凱基公司)培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，整個(gè)體系中DMSO終濃度控制在5‰以內(nèi)。10%胎牛血清及0.25%胰蛋白酶購自Gibco公司。BCA蛋白定量試劑盒購自美國(guó)Pierce公司。Ⅰ型鼠尾膠原蛋白購自天津衛(wèi)凱生物有限公司，包裝規(guī)格：10 mg。MatrigelTM基底膜基質(zhì)購自美國(guó)BD公司，包裝規(guī)格：5 mL。含Transwell小室的24孔板購自美國(guó)Corning公司。8 μm聚碳酸酯膜購自美國(guó)Corning公司。相關(guān)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自eBioscience公司。

1.2方法

1.2.1采用藥物總評(píng)分(MTS)法檢測(cè)雷公藤多甙對(duì)A375黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響A375細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰酶消化后離心計(jì)數(shù)，用DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，接種于96孔板，每孔200 μL細(xì)胞懸液，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞增長(zhǎng)至80%左右時(shí)，分別加入0、0.625、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μg/mL的雷公藤多甙和對(duì)照溶劑組(DMSO)孵育24 h，之后每孔加入MTS試劑20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。培養(yǎng)結(jié)束后，在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值(OD值)。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/陰性對(duì)照組OD值) ×100%。每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2A375裸鼠皮下移植瘤模型的建立及檢測(cè)雷公藤多甙對(duì)腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)的影響(1) 將購買的BALB/c裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。然后根據(jù)體質(zhì)量分成2組，選擇其中一組作為對(duì)照組(只接種腫瘤細(xì)胞，不接受任何藥物處理)；(2)常規(guī)培養(yǎng)A375黑色素瘤細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)前4～5 d，按1∶8比例將細(xì)胞傳代于75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，以免細(xì)胞生長(zhǎng)過度而出現(xiàn)不完全融合。每個(gè)培養(yǎng)瓶大約含(0.8～1.0)×107個(gè)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，用PBS沖洗2遍。加入1 mL 0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)，37 ℃消化1 min后，輕敲培養(yǎng)瓶使細(xì)胞脫落，加血清終止消化。轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，1 000 r/min，常溫離心3 min，棄上清液。加PBS吹打獲得單細(xì)胞懸液。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)將懸液濃度調(diào)節(jié)至1×107/mL，放置冰上備用；(3)用濃度為75%的乙醇消毒皮膚后，用1 mL注射器吸取0.2 mL(2×106個(gè)細(xì)胞)A375細(xì)胞懸液接種至裸鼠右后肢的背部皮下，每注射2只裸鼠，充分混勻細(xì)胞懸液后，繼續(xù)接種，接種完繼續(xù)飼養(yǎng)，每天觀察小鼠腫瘤的形成情況，接種7 d后，選擇造模成功的24只裸鼠，測(cè)定平均瘤體體積和體質(zhì)量進(jìn)行分組，分為模型組、雷公藤多甙低劑量組(10 mg/kg)、雷公藤多甙高劑量組(40 mg/kg)，每組5只，給藥21 d(藥物用食用油溶解，灌胃給藥；模型組給予不含藥的食用油)。每隔3天測(cè)量每只裸鼠的體質(zhì)量和瘤體體積；(4) 給藥21 d后將各組裸鼠頸椎脫臼處死，剪開皮膚后，小心地剝離整個(gè)瘤塊，稱質(zhì)量、拍照后，用4%多聚甲醛固定備用。

1.2.3Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)雷公藤多甙對(duì)A375黑色素瘤細(xì)胞侵襲的影響24孔板的Transwell小室(含8 μm聚碳酸酯膜)上室膜表面均勻鋪被含去生長(zhǎng)因子MatrigelTM的DMEM培養(yǎng)基稀釋液(1∶4,v/v)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱放置30 min使之凝固，備用。取含對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人黑色素瘤細(xì)胞株A375細(xì)胞懸液100 μL接種于上室，并加入相應(yīng)濃度的雷公藤多甙(0～2.5 μg/mL)，低血清培養(yǎng)(0.5%,v/v)，下室加入含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基600 μL。每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，作用24 h。24 h后取出小室，用棉拭子拭去上室中未遷移的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌后用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS漂洗3次后置于載玻片上，在200倍鏡下隨機(jī)選5個(gè)視野計(jì)數(shù)，將小室置于400 μL/孔的甲醇中將結(jié)晶紫溶解，取200 μL溶解液置于96孔板中，于370 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值，計(jì)算相對(duì)遷移率。

1.2.4小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)雷公藤多甙對(duì)A375黑色素瘤血管生成的影響(1) 將96孔板和無菌移液槍頭置于-20 ℃冰箱中預(yù)冷過夜；將保存于-20 ℃冰箱中的MatrigelTM基底膜基質(zhì)置于4 ℃冰箱中，緩慢解凍過夜待用;(2) 將預(yù)冷的96孔板置于冰板上，每孔加入100 μL MatrigelTM基底膜基質(zhì)。將其先置于4 ℃ 10 min，再置于37 ℃、5% CO2/95%空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中30 min;(3) 取指數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞(100 mm培養(yǎng)皿)，棄培養(yǎng)液。加10 mL PBS洗滌1次，棄去PBS后，加入4 mL 0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA，37 ℃消化2 min后，向其中加入5 mL完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，1 000 r/min離心3 min。配制細(xì)胞懸液，用適量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×105/mL。96孔板的每孔緩慢加入100 μL細(xì)胞混懸液;(4) 除空白對(duì)照組(Control)，每孔加入等體積的A375細(xì)胞培養(yǎng)上清液0.2 mL進(jìn)行培養(yǎng)。與此同時(shí)，不同濃度的雷公藤多甙(0～2.5 μg/mL)作用24 h后，分別于顯微鏡下觀察管腔形成情況并進(jìn)行拍照記錄。運(yùn)用Image J軟件分析管腔生成的長(zhǎng)度。

1.2.5ELISA檢測(cè)雷公藤多甙對(duì)A375黑色素瘤相關(guān)分泌因子的影響(1)配液：在PBS中加入0.05%吐溫-20，0.10% BSA配制成稀釋液；在PBS中加入1%BSA配制成封閉液；在PBS中加入0.05%吐溫-20配制成洗滌液；將100 μg/mL的捕獲抗體原液用稀釋液稀釋100倍至1 μg/mL配制成包被液。(2)板的制備：在96孔板中加入配制好的包被抗體溶液，每孔100 μL，用膜密封，4 ℃過夜；倒出每孔液體，每孔加入200 μL洗滌緩沖液清洗，吸水紙上拍干，后續(xù)洗滌液同此，重復(fù)4次；每孔加入300 μL封閉液，在室溫下孵育1 h；重復(fù)第2步中的清洗步驟。(3)檢測(cè)程序：將所有試劑放至室溫；稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，每孔加入100 μL的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，混合1 min，輕輕拍打板框，覆蓋膠條，室溫孵育2 h；重復(fù)洗滌；每孔加入100 μL檢測(cè)抗體，蓋上膠條，室溫孵育2 h；重復(fù)洗滌；每孔加入100 μL的鏈霉親和素-HRP(原液按稀釋倍數(shù)稀釋)，密封蓋板，在室溫下孵育30 min，避免放置在直射光下；重復(fù)洗滌；每孔加入100 μL底物，在室溫下孵育20～30 min。避免放置在直射光下；每孔加入50 μL終止液，輕輕搖晃板，確保充分混合；15 min后，設(shè)定酶標(biāo)儀450 nm處和570 nm處，檢測(cè)每孔的OD值。

2　結(jié)　　果

2.1雷公藤多甙對(duì)A375細(xì)胞的增殖具有抑制作用體外不同濃度的雷公藤多甙處理A375細(xì)胞24 h，結(jié)果表明雷公藤多甙在5.00 μg/mL時(shí)對(duì)A375細(xì)胞的增殖出現(xiàn)抑制，10.00、20.00 μg/mL濃度時(shí)可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并且呈現(xiàn)一定的量-效關(guān)系，見圖1。

*：P<0.05,**：P<0.01,與DMSO組比較。

圖1雷公藤多甙對(duì)A375黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響

2.2雷公藤多甙能夠抑制A375黑色素瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)裸鼠體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，雷公藤多甙能夠顯著抑制A375黑色素瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)，且具有一定的劑量依賴性，見圖2。

圖2　雷公藤多甙對(duì)裸鼠A375黑色素瘤皮下移植瘤體內(nèi)生長(zhǎng)的影響

*：P<0.05,**：P<0.001,與DMSO組比較。

圖3雷公藤多甙對(duì)A375黑色素瘤細(xì)胞遷移的影響(×200)

2.3雷公藤多甙能抑制A375黑色素瘤細(xì)胞的侵襲侵襲實(shí)驗(yàn)中，選取對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖無明顯抑制作用的濃度：0.625、1.25 μg/mL和2.5 μg/mL處理A375細(xì)胞24 h，結(jié)果表明雷公藤多甙在0.625 μg/mL時(shí)對(duì)A375細(xì)胞的侵襲出現(xiàn)抑制，1.25 μg/mL和2.5 μg/mL濃度可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲，并且具有一定的劑量依賴性，見圖3。

2.4雷公藤多甙能抑制腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的小管形成小管形成實(shí)驗(yàn)中，選取0、0.625、1.25、2.5 μg/mL雷公藤多甙及DMSO處理A375細(xì)胞24 h，結(jié)果表明，培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的上清液可以明顯的刺激小管形成。雷公藤多甙在0.625 μg/mL時(shí)對(duì)A375黑色素瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的小管形成具有抑制作用，1.25 μg/mL和2.5 μg/mL濃度可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的小管形成，并且具有一定的劑量依賴性，見圖4。

*：P<0.01，與DMSO組比較；**：P<0.01,與0 μg/mL組比較 。

圖4雷公藤多甙對(duì)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的小管形成的影響

2.5雷公藤多甙能夠抑制A375黑色素瘤細(xì)胞血管生成相關(guān)因子的分泌采用ELISA法對(duì)A375黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行檢測(cè)，考察雷公藤多甙對(duì)腫瘤細(xì)胞血管生成相關(guān)因子分泌的影響。結(jié)果表明雷公藤多甙能顯著抑制腫瘤血管生成相關(guān)因子的分泌，見圖5。

*：P<0.05,**：P<0.01,與DMSO組比較。

圖5雷公藤多甙對(duì)A375黑色素瘤細(xì)胞血管生成相關(guān)因子分泌的影響

3　討　　論

近年來黑色素瘤的發(fā)病率逐年升高，給人類的健康帶來巨大威脅[9]。目前，黑色素瘤的治療主要以手術(shù)切除病灶為主，輔以放療及化療[10]。該種方法對(duì)于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的黑色素瘤治療效果較為理想，但對(duì)于已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的黑色素瘤效果較差。因此找尋能夠有效治療黑色素瘤的藥物顯得尤為迫切。近年來，中藥在腫瘤的治療中受到了越來越多的重視，且大量臨床前研究顯示，多種中藥具有廣泛的抗腫瘤作用，如丹參[11-13]、川芎[14]等。

雷公藤多甙是從中藥雷公藤根中提取而來，大量研究表明，雷公藤多甙對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有較為廣泛的抗腫瘤作用，其主要通過抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[15]及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[7]發(fā)揮作用。目前，尚無雷公藤多甙治療黑色素瘤的相關(guān)研究報(bào)道，考慮到雷公藤多甙廣泛的抗腫瘤作用，那么其對(duì)近些年來發(fā)病率逐漸升高的黑色素瘤有無治療作用成為了研究的興趣點(diǎn)所在。

本研究從體內(nèi)、外考察了雷公藤多甙對(duì)A375黑色素瘤的影響，發(fā)現(xiàn)雷公藤多甙既能在體外抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，同時(shí)對(duì)體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)也具有抑制作用。同時(shí)，筆者也考察了雷公藤多甙對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的體外遷移的影響，發(fā)現(xiàn)雷公藤多甙能夠抑制腫瘤細(xì)胞的體外遷移?？紤]到腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移均依賴于腫瘤的血管生成[16]，因此筆者又考察了雷公藤多甙對(duì)腫瘤血管生成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雷公藤多甙能顯著抑制腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管生成。在腫瘤的血管生成過程中，多種因子參與其中，包括VEGF、bFGF、TGF-β及IL-8等，因此筆者又考察了雷公藤多甙對(duì)參與調(diào)控血管生成過程的這些因子的表達(dá)有何影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雷公藤多甙能夠顯著抑制VEGF、bFGF及IL-8的蛋白表達(dá)，但卻對(duì)TGF-β蛋白的表達(dá)沒有明顯影響，這表明雷公藤多甙對(duì)于黑色素瘤血管生成的調(diào)控不依賴于TGF-β。

綜上所述，本文從體外腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)及腫瘤血管生成角度考察了雷公藤多甙對(duì)A375黑色素瘤的影響，研究結(jié)果顯示，雷公藤多甙具有用于臨床治療黑色素瘤的潛能，這為雷公藤多甙后續(xù)的深入研究及藥物開發(fā)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of tripterygium on growth,invasion and angiogenesis of A375 melanoma and its action mechanisms

XuHongtao,HanZhongbao,ZhangHuili,MaLinwei

(TeachingandResearchingSectionofClinicalMedicine,YanchengInstituteofHealthVocationalTechnology,Yancheng,Jiangsu224005,China)

ObjectiveTo investigate the effect of tripterygium on the growth,invasion and angiogenesis of melanoma A375 and its action mechanisms.MethodsMTS was used to test the effect of tripterygium on proliferation of A375 melanoma;the nude mouse subcutaneous melanoma xenograft model was used to detect the effect of tripterygium on tumor growth;the Transwell experiment was used to determine the effect of tripterygium on invasion of A375 melanoma;the tubule formation experiment was used to determine the effect of tripterygium on tumor angiogenesis;ELISA was used to detect the influence of tripterygium on A375 cellular secretion factors,such as VEGF,bFGF,TGF-β and IL-8.ResultsThe in vitro proliferation and in vivo growth of A375 melanoma cells after tripterygium treatment were significant inhibited,the invasion ability of A375 melanoma cells was significant weakened compared with the control group;tripterygium could inhibit tumor cell-induced vessel formation by down-regulating the expression of VEGF,bFGF and IL-8 proteins,but it had no influence on expression of TGF-β protein.ConclusionTripterygium has anti-growth and anti-invasion effects on A375 melanoma,its potential mechanisms may associated with the inhibition of tumor angiogenesis of A375 melanoma.

Tripterygium;melanoma;growth;invasion;tumor angiogenesis;molecular mechanism

徐紅濤(1980-)，講師，碩士，主要從事動(dòng)脈粥樣硬化及血管生成研究。

R758.1

A

1671-8348(2016)20-2752-04

2015-12-15

2016-03-01)

論著·基礎(chǔ)研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.20.005