沈奎亞，劉梅，吳新安

(解放軍第一〇五醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥　230031)

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IL-17與TNF-α對HaCaT細胞IL-17R、p-p38 MAPK和炎癥因子表達的影響

沈奎亞，劉梅，吳新安

(解放軍第一〇五醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥230031)

摘要：目的考察IL-17與TNF-α共作用對皮膚角質形成細胞系HaCaT細胞IL-17R、p-p38 MAPK表達的影響，及其對HaCaT細胞分泌IL-6、IL-8、MIP-3α等炎癥因子的影響。方法采用RT-PCR方法檢測IL-17與TNF-α共作用對皮膚角質形成細胞IL-17R mRNA表達的影響；采用western blot方法檢測IL-17與TNF-α共作用對HaCaT細胞表達p-p38 MAPK的影響；采用ELISA法檢測IL-17與TNF-a共作用對HaCaT細胞分泌炎癥因子IL-6、IL-8及MIP-3α的影響。結果IL-17與TNF-α共作用可上調HaCaT細胞表達IL-17R和p-p38 MAPK，以及上調HaCaT細胞IL-6、IL-8、MIP-3α等炎癥因子的分泌。結論IL-17與TNF-α共作用可通過上調皮膚角質形成細胞IL-17R的表達，促進p38 MAPK的磷酸化過程而具有明顯致炎作用。

關鍵詞:白細胞介素17;腫瘤壞死因子α;AMP活化蛋白激酶類;趨化因子CCL20;白細胞介素6;白細胞介素8

角質形成細胞(Keratinocytes,KC)占表皮細胞80%以上，是由外胚層在分化的過程中形成具有保護作用的角蛋白，當受到侵襲時，其本身不僅具有皮膚屏障抵抗外界侵襲的能力，而且能啟動固有免疫和激活獲得性免疫，產生抗菌肽、β-防御素以及細胞和趨化因子，介導皮膚炎癥的發(fā)生發(fā)展[1-2]。人永生化表皮細胞(HaCaT)株來源于人皮膚，培養(yǎng)時呈正常的上皮樣細胞形態(tài)，貼壁生長，對培養(yǎng)條件要求不高，培養(yǎng)、傳代、冷凍均較容易，與正常人角質形成細胞具有相似的分化特征，作為體外抗菌藥研究的模型是一很好的選擇。IL-17在保護宿主防御感染中起到關鍵作用，其可以與白介素-17受體(IL-17R)結合進行信號轉導后發(fā)揮作用，也能夠誘導介導防御反應的TNF-a、IL-1b、IL-6等促炎癥因子參與到很多免疫性疾病及炎癥發(fā)生與發(fā)展的過程中。TNF-α也是致炎因子之一，它可以通過死亡受體途徑促進細胞的凋亡[3]；在強直性脊柱炎患者中高表達，是其發(fā)病過程中重要的致炎因子[4]，Meta分析也證實兩者有一定的關聯(lián)[5]；與冠心病也有一定的相關性[6]。據(jù)報道，IL-17與TNF-α有協(xié)同作用，但其機制尚不清楚。p38 MAPK信號分子對炎癥因子和應急信息進行信號轉導，從而參與調控炎癥介質的基因表達過程。因此，本研究從IL-17與TNF-α二者間的相互作用著手，探討IL-17與TNF-α共作用的可能作用機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品與試劑胰蛋白酶(AMRESCO)；小牛血清(四季清生物)；胎牛血清(GIBCO公司，Invitrogen Corporation)； RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO/BRL)；MTT(AMRESCO)；二甲基亞砜(中國醫(yī)藥集團)；青霉素(80萬U，華北制藥)；鏈霉素(1 g，華北制藥)；新生牛血清(杭州四季青)；小鼠抗人IL-17R單克隆抗體(R&D systems)；小鼠抗人p38 MAPK單克隆抗體(R&D systems)；小鼠抗人p-p38 MAPK單克隆抗體(R&D systems)；HRP標記山羊抗小鼠IgG(南京金思特)；焦碳酸二乙酯(Bio Basic Inc.)；電泳瓊脂糖(Bio Basic Inc.)；溴化乙錠(AMRESCO)；BCA蛋白測定試劑盒(PIERCE CO.)；Supersignal West Femto 顯影試劑盒(PIERCE CO.)；苯甲磺酰氟(Calbiochem CO.)；四甲基乙二胺(上海華舜生物)；預染蛋白Marker(19-120KD，晶美公司)； UNIQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒(上海生工生物)；RT-PCR試劑盒(寶生物工程)。

1.1.2儀器CO2培養(yǎng)箱(FORMA，美國)；PCR儀(Biometra，德國)；生物潔凈工作臺(SDJ-ZS型，上海)；生物電泳圖像分析系統(tǒng)(FR-980型，上海復日科技)；高速臺式離心機(TGL-168，上海安亭公司)；超低溫冰箱(HARRIS公司，美國)；PCR分析軟件(Roche diagnostics公司，美國)；超聲振蕩儀(DL-720型，浙江海天)；磁力攪拌器(79-2型，廣東國華)；電泳儀(M-250型，上海百特科技)；微量移液器(NICHIRYO公司，日本)；數(shù)顯式三用恒溫水溫箱(上海躍進)；脫色搖床(上海琪特儀器)；微型渦旋混合器(上海躍進)；垂直電泳系統(tǒng)(Mini-PROTEA，美國Bio-Rad公司)；轉印系統(tǒng)(Mini Trans-Blot，美國Bio-Rad公司)；UVP Bioimaging Systems(美國UPLand公司)。

1.2方法

1.2.1RT-PCR分析將培養(yǎng)接近融合狀態(tài)的HaCaT細胞提取總RNA，按RT-PCR試劑盒方法首先逆轉錄合成cDNA，IL-17R的擴增片段長186 bp，其正義引物cactcactctacgcaaccttaa，反義引物agatgcccgtgatgaacc。內參GAPDH擴增片段長133 bp，其正義引物aacggatttggtcgtcgtattgg，反義引物gggtggaatcatattggaaca。PCR的反應條件為：變性(95 ℃，30 s)、退火(55 ℃，30 s)、延伸(72 ℃、1 min)，共計循環(huán)35次，最后與72℃延伸5 min。將PCR產物電泳，電泳后置電泳圖像分析系統(tǒng)中進行處理分析。最后將產物分離純化并測序，用BLAST程序比對分析測得序列與Genebank的已知序列。

1.2.2Western印跡分析將培養(yǎng)瓶中接近融合的HaCaT細胞抽去上清液，依次加入無血清的培養(yǎng)基、含IL-17(10 μg·L-1)的培養(yǎng)基、含TNF-α(10 μg·L-1)的培養(yǎng)基及含IL-17與TNF-α各10 μg·L-1的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在冰浴下用改良型RIPA細胞裂解液對細胞進行裂解0.5 h收集蛋白樣品，為保證蛋白上樣量濃度一致，用BCA蛋白濃度測定試劑盒總蛋白濃度。配制SDS-PAGE凝膠，將蛋白樣品與沸水浴加熱5 min充分變性，冷卻后上樣并電泳。用PVDF膜轉膜，電壓設定為60 V,轉膜1 h。封閉液封閉1 h后，分別加入各1 mL的一抗p38 MAPK、p-p38 MAPK、GAPDH小鼠單克隆抗體(稀釋比例為1∶500)，4℃孵育。次日再加入1 mL的二抗稀釋比例為1∶1 000的HRP標記的山羊抗小鼠IgG，孵育后洗膜，按顯影試劑盒操作顯影后置UVP成像系統(tǒng)中攝像，根據(jù)目的基因和內參基因的條帶灰度值進行分析。

1.2.3ELISA測定將培養(yǎng)板上近融合的HaCaT細胞分別加入無血清的培養(yǎng)基、含IL-17(10 μg·L-1)培養(yǎng)基、含TNF-α(10 μg·L-1)的培養(yǎng)基、含IL-17和TNF-α各(10 μg·L-1)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將上清液吸取后，在離心機上以1 000 r·min-1的速度離心5 min。以試劑盒的方法測定上清液中IL-6、IL-8、MIP-3α的含量。

2　結果

2.1IL-17與TNF-α共作用對HaCaT細胞IL-17R mRNA表達的影響PCR產物的電泳圖(圖1)顯示，IL-17R在HaCaT細胞上有明顯表達，產物片段大小與設計一致，條帶較清晰，未見雜帶。較正常對照組相比，IL-17與TNF-α共作用刺激HaCaT細胞24 h后，IL-17R mRNA的表達量上調95.6%，較正常對照組相比，差異明顯(P<0.01)。IL-17(10 μg·L-1)單獨應用可使IL-17R mRNA的表達量上調51.2%，TNF-α(10 μg·L-1)單獨應用可使IL-17R mRNA的表達量上調78.3%，兩者均較正常對照組差異明顯(P<0.01)。PCR產物經(jīng)分離純化，進行測序。測得序列用BLAST程序通過Internet與Genebank的已知序列進行比對分析，HaCaT細胞IL-17R的序列與已知人IL-17R序列的同源性達100%。

2.2IL-17與TNF-α共作用對HaCaT細胞p-p38 MAPK表達的影響Western blot結果見圖2。較空白對照組而言，各處理組對HaCaT細胞表達p38 MAPK的作用不明顯，而對p-p38 MAPK有明顯影響。據(jù)灰度值測定，IL-17與TNF-α共作用可使HaCaT細胞上p-p38 MAPK的表達量明顯上升，分別較空白對照組、IL-17組、TNF-α組升高1.5、0.8、0.5倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

注：1:control;2:IL-17 10 μg·L-1;3:TNF-α 10 μg·L-1;4 IL-17 10 μg·L-1+ TNF-α 10 μg·L-1。

圖1IL-17與TNF-α共作用對HaCaT細胞表達

IL-17R mRNA的影響

注：1:control;2:IL-17 10 μg·L-1;3:TNF-α 10 μg·L-1;4:IL-17 10 μg·L-1+ TNF-α 10 μg·L-1。

圖2不同刺激因素對HaCaT 細胞上p38和p-p38 MAPK表達的影響

2.3IL-17與TNF-α共作用對HaCaT細胞IL-6、IL-8、MIP-3α等炎癥因子分泌的影響IL-17與TNF-α共作用刺激HaCaT細胞24 h后，用ELISA試劑盒測定細胞上清液中IL-6、IL-8、MIP-3α的濃度，ELISA結果見表1。HaCaT細胞自身可分泌少量IL-6、IL-8、MIP-3α。以IL-17(10 μg·L-1)刺激HaCaT細胞24 h后，IL-17可顯著增加HaCaT細胞IL-6、IL-8、MIP-3α的分泌量，分別為對照組的1.4倍、1.1倍和1.7倍。TNF-α可亦可升高IL-6、IL-8、MIP-3α的表達水平，其表達量明顯高于對照組(P<0.01)。將IL-17(10 μg·L-1)與TNF-α(10 μg·L-1)共孵育，IL-6、IL-8、MIP-3α的表達量明顯上調，較單用IL-17組分別升高530%、24.2%、70.1%，較單用TNF-α分別升高90.3%、10.0%、13.1%。

表1　IL-17與TNF-α共作用對HaCaT細胞分泌 IL-6、IL-8、MIP-3α的影響

注：與對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與IL-17組比較，cP<0.01。

3　討論

IL-17有六個家族成員，其中IL-17A、IL-17E及IL-17F是重要的促炎癥因子，它具有可誘導中性粒細胞趨化、調控細胞因子的釋放等廣泛的生物學效應。IL-17可以促進中性粒細胞、巨噬細胞、內皮細胞、上皮細胞等分泌炎癥因子、趨化因子及黏附分子，如MMP3、G-CSF、IL-6、IL-8、ICAM-1等。IL-17可促進樹突狀細胞的分化成熟，并可誘導TNF-α、iNOS、LIF、MCP-1、MCP-2、PGE2等的釋放，這些分子在炎癥、免疫的不同階段具有不同的功能。在缺血再灌注損傷、炎癥性腸病、類風濕性關節(jié)炎中也起到一定作用[7-9]。

TNF-α是一種單核因子，主要由活化的單核細胞和巨噬細胞產生。不僅可以殺傷或抑制腫瘤細胞，還有抗感染以及提高中性粒細胞的吞噬能力。TNF-α有中性粒細胞和單核細胞趨化作用，從而釋放炎癥介質。本文考察了IL-17與TNF-α共作用對HaCaT細胞IL-17R的影響，RT-PCR結果顯示，IL-17、TNF-α均使IL-17R mRNA的表達量提高，IL-17與TNF-α共作用對HaCaT細胞上IL-17R的表達有明顯的上調作用，表現(xiàn)為很強的協(xié)同作用。

p38 MAPK通過磷酸化作用在信號轉導過程中激活許多炎癥轉錄因子，調節(jié)細胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等基因表達，還能激活細胞內的某些蛋白激酶，進一步磷酸化而參與細胞應激反應。p38途徑對許多炎癥介質的基因表達起調控作用，反過來炎癥介質也能激活p38 MAPK進而作用于p38 MAPK下游底物，從而在形成一個逐級放大的炎癥反應過程。p38激活的過程為：炎癥刺激信號通過多級磷酸化反應激活MEK3/6，MEK3/6使p38 MAPK特定的Thr-Gly-Tyr基序中的Thr和Tyr磷酸化，進而激活p38 MAPK的下游分子，如ATF2、NF-κB等。皮膚炎癥變化過程中，浸潤的炎癥細胞及皮膚組織細胞之間可能存在著廣泛的信號聯(lián)系。Western blot結果顯示，IL-17能提高p-p38 MAPK的表達，而IL-17與TNF-α共作用可協(xié)同升高p-p38 MAPK的表達。

IL-6是一種具有多種生物學效應的細胞因子，是重要的致炎因子之一，能調節(jié)和介導其他細胞因子的表達。在全身炎癥反應綜合征中因誘導急性期蛋白合成與分泌而發(fā)揮重要作用[10]。IL-8是一種能吸引白細胞到達感染部位的趨化因子，在炎癥反應中扮演著重要角色，有促進中性粒細胞的游走和趨化作用。CCL20基因編碼的MIP-3α(人巨噬細胞炎性蛋白3α)對免疫性T細胞具強有力的趨化作用，并可活化和趨化淋巴細胞，已經(jīng)成為皮膚炎癥疾病中的新靶點。本研究考察了IL-17與TNF-α共作用角質形成細胞分泌MIP-3α、IL-6、IL-8的影響。結果顯示，角質形成細胞可分泌少量的MIP-3α、IL-6、IL-8，IL-17對這些炎癥因子的產生起積極作用，IL-17與TNF-α共作用對皮膚細胞炎癥因子的表達有明顯促進作用。這可能是IL-17與TNF-α共作用致炎作用顯著增強的重要原因。

綜上所述，IL-17與TNF-α共作用可通過協(xié)同促進IL-17R的表達，進而協(xié)同促進p38 MAPK的磷酸化過程而具有顯著的致炎作用。

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通信作者：吳新安，男，副主任藥師，碩士生導師，研究方向：醫(yī)院藥學，E-mail:xinanw@21cn.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.020

(收稿日期：2016-02-11，修回日期：2016-04-08)

Co-effect of IL-17 and TNF-α on the expressions of IL-17R,p-p38 MAPK andinflammatory factors in cultured keratinocytes

SHEN Kuiya,LIU Mei,WU Xinan

(DepartmentofPharmacy,105thHospital,Hefei,Anhui230031,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the co-effect of IL-17 and TNF-α on the expressions of IL-17R,p-p38 MAPK in skin keratinocyte cell line HaCaT cells,and on the levels of IL-6,IL-8,MIP-3α secreted by HaCaT cells.MethodsRT-PCR method was applied to analyze the expression of IL-17R mRNA in HaCaT cells treated with IL-17 and TNF-α in combination;Western blot method to study the expression of p-p38 MAPK;ELISA assay to analyze the level of inflammatory factors IL-6,IL-8 and MIP-3α.ResultsCo-effect of IL-17 and TNF-α could increase the expressions of IL-17R and p-p38 MAPK in HaCaT cells,as well as increase the levels of IL-6,IL-8,MIP-3α secreted by HaCaT cells.ConclusionsCo-effect of IL-17 and TNF-α can promote the expression of IL-17R,stimulate the phosphorylation of p38 MAPK,and increase the expressions of IL-6,IL-8,MIP-3α.So co-effect of IL-17 and TNF-α have played a significant proinflammatory role.

Key words:Interleukin-17;Tumor Necrosis Factor-alpha;AMP-Activated Protein Kinases;Chemokine CCL20;Interleukin-6;Interleukin-8