韓 深，賈芳芳，崔海峰，劉 螢，魯亞輝，王兆芹，桂 淦

(1.北京出入境檢驗檢疫局，北京 100026；2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；3.北京市食品安全免疫快速檢測工程技術(shù)研究中心，北京 102206；4.合肥市畜牧水產(chǎn)技術(shù)推廣中心，安徽合肥 230001)

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三甲氧芐氨嘧啶單克隆抗體制備以及酶聯(lián)免疫試劑盒的研究

韓 深1，賈芳芳2，3，崔海峰2，3，劉 螢1，魯亞輝2，3，王兆芹2，3，桂 淦4

(1.北京出入境檢驗檢疫局，北京 100026；2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；3.北京市食品安全免疫快速檢測工程技術(shù)研究中心，北京 102206；4.合肥市畜牧水產(chǎn)技術(shù)推廣中心，安徽合肥 230001)

[目的]探討系統(tǒng)地檢測水質(zhì)中三甲氧芐氨嘧啶殘留量的方法。[方法]通過三甲氧芐氨嘧啶與馬來酸酐反應(yīng)，得到三甲氧芐氨嘧啶半抗原，再通過免疫動物得到抗三甲氧芐氨嘧啶單克隆抗體，并將其應(yīng)用于能夠檢測水質(zhì)中三甲氧芐氨嘧啶殘留量的ELISA試劑盒。[結(jié)果]試驗表明，該試劑盒對水質(zhì)中三甲氧芐氨嘧啶的檢測限為2.34 μg/kg，IC50(50%抑制濃度)為4.8 μg/L，回收率為60.5%～79.7%，試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0～80 μg/L，批內(nèi)、批間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，三甲氧芐氨嘧啶單克隆抗體與二甲氧芐氨嘧啶的交叉反應(yīng)率小于1%，4 ℃下能夠保存12個月，穩(wěn)定性較好。[結(jié)論]研究可為監(jiān)管三甲氧芐氨嘧啶的濫用提供參考。

三甲氧芐氨嘧啶；單克隆抗體；ELISA試劑盒

三甲氧芐氨嘧啶(Synaprim，TMP)[1]屬于二氨嘧啶類化合物[2]，它是一種抗菌增效劑[3-4]。磺胺類藥物單獨使用，會使細菌很易產(chǎn)生耐藥性，將三甲氧芐氨嘧啶與磺胺類藥物組成復(fù)方制劑，可使細菌的葉酸代謝受到雙重阻斷，使抗菌譜擴大、抗菌活性增強，從抑菌作用變?yōu)闅⒕饔?，對多?shù)革蘭氏陽性菌和陰性菌有效，在獸醫(yī)臨床上應(yīng)用十分廣泛?；前吩鲂┛砂l(fā)生瘙癢、皮疹，臨床也有發(fā)現(xiàn)服用頭孢羥氨芐/TMP 致過敏性休克的報道，也有發(fā)生惡心、嘔吐、腹瀉等胃腸道反應(yīng)[5-7]。磺胺增效劑對小白鼠的半數(shù)致死量(LD50)為2 500 mg/kg體重。大劑量使用時，可影響葉酸代謝和作用，可致白細胞減少和血小板減少，故長期使用時必須注意。為了保護人類健康，各國對動物源性食品中甲氧芐氨嘧啶殘留量的檢測很重視，均制定了嚴(yán)格的限量要求。例如：歐盟、我國香港政府規(guī)定牛、豬和家禽組織中殘留限量為0.05 mg/kg。我國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《無公害食品水產(chǎn)品中漁藥殘留限量》(NY 5070—2002)中規(guī)定了以磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑4種藥物按總量計最大殘留限量為100 μg/kg，甲氧芐啶最大殘留限量為50 μg/kg[8]。

目前磺胺類及其增效劑殘留的測定方法有高效液相色譜法配合紫外檢測器、熒光檢測器和質(zhì)譜檢測器，但大多采用國外產(chǎn)的凈化小柱處理樣品，增加了測定成本。目前尚鮮有關(guān)于磺胺類藥物增效劑的系統(tǒng)檢測方法，筆者制備了抗三甲氧芐氨嘧啶單克隆抗體，同時開發(fā)了檢測水質(zhì)中三甲氧芐氨嘧啶殘留量的酶聯(lián)免疫試劑盒，以期為監(jiān)管濫用三甲氧芐氨嘧啶提供有效手段。

1　材料與方法

1.1材料三甲氧芐氨嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品，北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；氫氧化鈉、乙酸乙酯、磷酸鹽、卵清蛋白、牛血清白蛋白，北京百欣試劑公司；水質(zhì)，購自超市；復(fù)溶工作液，北京勤邦生物技術(shù)有限公司。

酶標(biāo)儀(最大量程為4.0)，上海雷勃分析儀器有限公司；振蕩器、渦旋儀，湖南湘立科學(xué)儀器有限公司。

1.2制備抗原

1.2.1制備半抗原。取0.58 g三甲氧芐氨嘧啶，0.40 g馬來酸酐和1 mL吡啶溶解于10 mL二甲基亞砜(DMSO)中，在40 ℃下攪拌反應(yīng)12 h，蒸除溶劑，柱層析后在乙醇-水體系中重結(jié)晶得到三甲氧芐氨嘧啶單馬來酸酰胺[9]。

1.2.2制備免疫原。取8.5 mg三甲氧芐氨嘧啶半抗原，溶解于1 mL二甲基甲酰胺(DMF)中；取15 mg碳化二亞胺(EDC)用0.2 mL水充分溶解后于加入半抗原的溶解液中，室溫下攪拌24 h，即可得到反應(yīng)液A。稱取牛血清白蛋白40 mg，使之充分溶解在2.8 mL pH 為7.2 的PBS中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24 h；用0.01 mol/L PBS在4 ℃透析3 d，每天換3 次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；分裝，于-20 ℃保存?zhèn)溆肹9]。

1.2.3制備包被原。反應(yīng)液A制備同“1.2.2”；稱取卵清蛋白30 mg，使之充分溶解在2.8 mL pH 為7.2 的PBS 中，將反應(yīng)液A 逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24 h；用0.01 mol/L PBS 在4 ℃透析3 d，每天換3 次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；分裝，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1　半抗原的制備Fig.1　Synthesis of Trimethoprem hapten

1.3制備酶標(biāo)記抗抗體將“1.2”得到的免疫原注入Balb/c小鼠體內(nèi)，產(chǎn)生抗血清。取免疫Balb/c小鼠脾細胞，與SP2/0骨髓瘤細胞融合，進行克隆化，獲得穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。將雜交瘤細胞置于細胞培養(yǎng)基中，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進行純化，得到三甲氧芐氨嘧啶單克隆抗體[10]，用該抗體免疫無病原體羊，得到羊抗鼠抗抗體[11]，將羊抗鼠抗抗體與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)[12]，最終得到酶標(biāo)記抗抗體。

1.4優(yōu)選抗原包被濃度、單克隆抗體濃度，制備酶標(biāo)板按照下列公式計算0、0.5 μg/L濃度的三甲氧芐氨嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品的百分吸光率，測定波長為450 nm，抗原稀釋倍數(shù)依次為：1∶1 000、1∶3 000、1∶9 000；單克隆抗體稀釋倍數(shù)依次為：1∶10 000、1∶30 000、1∶90 000、1∶270 000；酶標(biāo)記抗抗體液的稀釋倍數(shù)為1∶1 000。

百分吸光率(%)=(標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液的平均吸光度值/0 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值)×100%

將100 μL抗原包被液包被于酶標(biāo)板中，37 ℃下孵育2 h，清洗酶標(biāo)板之后，加入150 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%BSA的0.02 mol/L PBS緩沖液，37 ℃下孵育2 h[13]，即制備完成酶標(biāo)板。

1.5水質(zhì)樣本的前處理方法取水樣100 μl至2 mL離心管中，加入400 μL復(fù)溶工作液，用渦旋儀充分渦動，混勻；取50 μL用于分析。

1.6酶標(biāo)板檢測向“1.4”制備完成的酶標(biāo)板中依次加入濃度為0、0.5、2、6、20、80 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以及“1.5”前處理完成的水質(zhì)樣本溶液，每孔均為50 μL，再加入抗體液，每孔50 μL，室溫避光反應(yīng)30 min。清洗酶標(biāo)板，然后每孔加入“1.3”制備的酶標(biāo)記抗抗體100 μL，室溫避光反應(yīng)30 min。清洗酶標(biāo)板，然后每孔加入50 μL H2O2，然后每孔再加入50 μL四甲基聯(lián)苯胺，室溫避光反應(yīng)15 min。最后每孔加入2 mol/L H2SO450 μL，測定酶標(biāo)板孔的OD450 nm值。

1.7計算水質(zhì)樣本中三甲氧芐氨嘧啶含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為三甲氧芐氨嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/L)的對數(shù)，縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率，然后將水質(zhì)樣本的OD450 nm代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相應(yīng)的濃度，該濃度乘以稀釋倍數(shù)即為水質(zhì)樣本中三甲氧芐氨嘧啶殘留量。

1.8檢測性能

1.8.1計算檢測限。分別檢測20份水體空白樣本，利用空白樣本濃度的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差，計算檢測限(LOD)，即檢測方法可檢測出的最低被測物濃度[14]。

1.8.2精密度和準(zhǔn)確度。分別對水質(zhì)樣本添加三甲氧芐氨嘧啶，使其濃度達到2.5、5.0和10.0 μg/kg，測定添加回收率，以此評價該試劑盒的準(zhǔn)確度。同時，每個樣本做4個平行，按照上述“1.4”制備3批酶標(biāo)板，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，以此評價該試劑盒的精密度。

1.8.3測定穩(wěn)定性。通過測定試劑盒的保存條件，評價該試劑盒的穩(wěn)定性。將試劑盒保存于4 ℃，每個月測定一次最大吸光度值(0 μg/L)、IC50以及水質(zhì)樣本的回收率，連續(xù)測定12個月。

1.8.4測定抗體特異性。二甲氧芐氨嘧啶與三甲氧芐氨嘧啶的結(jié)構(gòu)類似，測定這3種藥物的IC50，根據(jù)下式計算該試劑盒對于二甲氧芐氨嘧啶的交叉反應(yīng)率：

交叉反應(yīng)率(%)=

2　結(jié)果與分析

2.1鑒定半抗原利用核磁共振氫譜法測定“1.2.1”制備的半抗原，新增加的12.0 左右的羧基信號峰以及6～7間的烯烴信號峰說明半抗原合成成功。

2.2優(yōu)選抗原包被濃度、單克隆抗體濃度測定濃度為0和0.5 μg/L的三甲氧芐氨嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品的OD450 nm，見表1。

表1抗原、抗體的濃度優(yōu)選(OD450 nm)

Table 1The suitable concentration of antigen and antibody(OD450 nm)

單抗稀釋倍數(shù)Monoclonalanti-bodydilutionratio測定濃度Concentrationdeterminationμg/L抗原稀釋倍數(shù)Antigendilutionratio1∶10001∶30001∶90001∶1000003.2723.2103.1570.53.1923.2053.0971∶3000002.8643.2942.9770.52.7703.3003.0821∶9000002.3522.3292.0040.52.0371.9551.9101∶27000001.2481.6501.8590.51.3441.6031.506

當(dāng)OD450 nm(0.5 μg/L)/OD450 nm(0 μg/L)的抑制率在70%～85%時，以抗原、單克隆抗體的最大稀釋倍數(shù)作為抗原、單克隆抗體的最佳稀釋倍數(shù)[15]。由此可見，該研究優(yōu)選抗原稀釋倍數(shù)為9 000，最佳單克隆抗體稀釋倍數(shù)為270 000。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗表明(表2，圖2)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍為0～80 μg/L，IC50(50%抑制濃度)為4.8 μg/L；線性方程y=-1.523x+1.172，R2為0.994。

表2　標(biāo)準(zhǔn)曲線的酶聯(lián)免疫法測定(n=6)

圖2　標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Fig.2　Standard curve equation

2.4計算檢測限由表3可見，各供試樣本檢測結(jié)果平均值為0.83 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)差0.50，該研究對水質(zhì)樣本的檢測限為2.34 μg/kg。

表3　水質(zhì)空白樣本檢測限測定結(jié)果

2.5精密度和準(zhǔn)確度測定添加不同濃度三甲氧芐氨嘧啶的水質(zhì)樣本，回收率范圍是60.5%～79.7%，可見當(dāng)添加濃度為2.5、5.0和10.0 μg/kg時，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍是5.0%～9.5%；批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍是7.5%～9.1%。具體見表4。

2.6測定穩(wěn)定性將試劑盒保存在4 ℃，測定的試劑盒的最大吸光度值(0 μg/L)范圍是1.60～1.93，50%抑制濃度范圍是3.2～5.4 μg/L，三甲氧芐氨嘧啶添加回收率范圍是61.8%～77.8%。由此可見，各指標(biāo)均在正常范圍之內(nèi)(表5)。從測定結(jié)果可知，該試劑盒在4 ℃至少能夠保存12個月。

表4　水質(zhì)精密度及準(zhǔn)確度試驗

2.7測定抗體特異性該試驗得出，三甲氧芐氨嘧啶抗體與二甲氧芐氨嘧啶的交叉反應(yīng)率小于1%。

3　結(jié)論與討論

該研究制備了抗三甲氧芐氨嘧啶單克隆抗體，并研發(fā)出相應(yīng)的ELISA試劑盒，優(yōu)選出抗原包被濃度和單克隆抗體濃度，試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍0～80 μg/L，對水質(zhì)的檢測限為2.34 μg/kg，回收率為60.5%～79.7%，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍是5.0%～9.5%，批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍是7.5%～9.1%。三甲氧芐氨嘧啶單克隆抗體的特異性較好，與二甲氧芐氨嘧啶的交叉反應(yīng)率小于1%。ELISA試劑盒能夠在4 ℃下保存12個月，主要指標(biāo)在正常范圍內(nèi)，可見穩(wěn)定性較好[16]。萬宇平等應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)建立了一種快速檢測食品中三甲氧芐氨嘧啶(TMP)的方法，該方法檢測的樣本為牛奶，靈敏度為50 μg/L[9]。高洋洋等建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS /MS)測定多種基質(zhì)(雞肉、魚肉、

表5　試劑盒在4 ℃保存的穩(wěn)定性

雞肝、雞蛋和牛奶)中三甲氧芐氨嘧啶的分析方法，定量限(信噪比為10)為5.0μg/kg[17]。而該試驗對水質(zhì)中三甲氧芐氨嘧啶的檢測限為2.34μg/kg，優(yōu)于上述指標(biāo)。

[1] 楊長志，康慶賀，馬東升，等.高效液相色譜法測定動物源性食品中甲氧芐氨嘧啶殘留量[J].化學(xué)工程師，2005(12)： 19-21.

[2] 楊成對，宋莉暉.磺胺甲惡唑和甲氧芐啶在水產(chǎn)品中殘留的檢測[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2008，18(4)： 624-625.

[3] 薛鳳梅.獸用抗菌增效劑[J].養(yǎng)殖技術(shù)顧問，2011(5)： 235.

[4] 陳瑞玲.磺胺類藥與甲氧芐啶的合理應(yīng)用[J].中國臨床醫(yī)生，2008，36(7)： 18-20.

[5] 王新，崔一喆，韓鐵鎖.甲氧芐啶對黃芩苷體外抗菌增效作用的試驗[J].中國獸醫(yī)雜志，2010(11)： 69-70.

[6] 張金標(biāo)，王泮之.頭孢羥氨芐-甲氧芐啶致過敏性休克1例[J].中國藥師，2004，7(2)： 116-117.

[7] 劉玲.甲氧芐氨嘧啶(TMP)中毒一例[J].蚌埠醫(yī)藥，1990，8(2)： 82.

[8] 梅光明，陳雪昌，張小軍，等.高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中殘留的甲氧芐啶[J].食品科學(xué)，2010，31(6)：248-251.

[9] 萬宇平，馮才偉，趙正苗，等.三甲氧芐氨嘧啶膠體金免疫層析檢測試紙條的研制[J].中國乳品工業(yè)，2013，41(2)：24-27.

[10] 劉小軍，馮才偉，馮靜，等.一種葉酸的酶聯(lián)免疫快速檢測試劑盒的研制[J].食品工業(yè)科技，2013，34(23)：303-310.

[11] 楊利國，胡少昶，魏平華，等.酶聯(lián)免疫技術(shù)[M].南京：南京大學(xué)出版社，1998.

[12] 郭春祥，郭錫瓊.介紹一種簡單、快速、高效的辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體的過碘酸鈉法[J].上海免疫學(xué)雜志，1983，3(2)：97-100.

[13] 鄭百芹，羅曉琴，馮才偉，等.一種喹諾酮類藥物的酶聯(lián)免疫快速檢測試劑盒的研制[J].中國釀造，2014，33(2)：130-133.

[14] 馮仁豐.分析靈敏度(檢測限)[J].上海醫(yī)學(xué)檢驗雜志，2002，17(3)：133-136.

[15] 董李學(xué)，馮才偉，馮靜，等.抗氧氟沙星單克隆抗體的制備及ELISA快速試劑盒的初步研制[J].中國畜牧獸醫(yī)，2014，41(8)：90-94.

[16] 唐偉國.醫(yī)學(xué)檢驗診斷試劑的制備與應(yīng)用[M].上海：上海科技文獻出版社，1996：99.

[17] 高洋洋，張朝暉，盧曉宇，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源性食品中的三甲氧芐氨嘧啶[J].分析試驗室，2014，33(3)：315-318.

Study on the Production of Trimethoprem Monoclonal Antibodies and Its ELISA Kit for Rapid Detection

HAN Shen1, JIA Fang-fang2,3, CUI Hai-feng2,3et al

(1. Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Beijing 100026; 2.Beijing Kwinbon Biotechnology Company, Beijing 102206; 3. Beijing Egineering Research Centre of Food Safety Immunodetection, Beijing 102206)

[Objective] The aim was to discuss the method for detecting Trimethoprem residues in water. [Method] The synthesized Trimethoprem hapten was prepared from a sequence of reactions that used Trimethoprem and Maleic anhydride. And Trimethoprem monoclonal antibodies were prepared by animal immune. And ELISA kit was prepared. Then the limit of detection and relative standard deviation(RSD) of trimethoprem ELISA was studied. [Result] The limit of detection was 2.34 μg/kg, with theIC50values 4.8 μg/L. The recoveries were between 60.5%-79.7%. The standard curve ranged from 0 to 80 μg/L, andRSDwas less than 10%. The cross reaction rate with Diaveridine was less than 1%. The stability tests results revealed that the kit can be kept at 4 ℃ for 12 months. [Conclusion] The study can provide reference for administration of the abuse of Trimethoprem.

Trimethoprem; Monoclonal antibodies; Enzyme linked immunosorbent assay kit(ELISA)

北京市科技計劃課題(Z151100002115059)。

韓深(1981- )，男，北京人，工程師，從事食品安全檢測研究。

2016-05-13

TS 207.3

A

0517-6611(2016)17-091-03