張壯麗，趙　寧，王亞飛，鄒　敏，趙志鴻，張小俊，王桂芳

1)河南省醫(yī)藥科學研究院藥化室 鄭州450052　2)鄭州市第六人民醫(yī)院藥務科 鄭州 450001　3)鄭州大學藥學院 鄭州 450001　△女，1978年1月生，博士，副研究員，研究方向：中藥新藥研究，E-mail：zzl7814@163.com

?

魚腥草揮發(fā)油對Raji細胞增殖和凋亡的影響*

張壯麗1)△，趙寧2)，王亞飛3)，鄒敏1)，趙志鴻1)，張小俊1)，王桂芳1)

1)河南省醫(yī)藥科學研究院藥化室 鄭州4500522)鄭州市第六人民醫(yī)院藥務科 鄭州 4500013)鄭州大學藥學院 鄭州 450001△女，1978年1月生，博士，副研究員，研究方向：中藥新藥研究，E-mail：zzl7814@163.com

摘要目的：研究魚腥草揮發(fā)油對Raji細胞增殖與凋亡的影響。方法：采用MTT法觀察不同體積分數(shù)的魚腥草揮發(fā)油體外誘導Raji細胞24、48和72 h對細胞增殖的影響；分別采用Annexin V-FITC/PI雙染法及PI單染法檢測不同體積分數(shù)的魚腥草揮發(fā)油處理Raji細胞48 h后細胞凋亡及細胞周期的改變。結果：魚腥草揮發(fā)油誘導Raji細胞24、48和72 h的IC50(V/V)分別為0.125 80×10-3、0.099 58×10-3和0.105 22×10-3，且隨魚腥草揮發(fā)油體積分數(shù)的增加，細胞增殖抑制率及凋亡率均呈升高的趨勢(P<0.05)；細胞周期檢測結果表明魚腥草揮發(fā)油將細胞阻滯于G0/G1期。結論：魚腥草揮發(fā)油能夠顯著抑制Raji細胞的增殖，誘導細胞凋亡；其作用機制可能與阻滯細胞G1/M轉化有關。

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma，NHL)是一組起源于淋巴結、骨髓、脾臟等淋巴組織的惡性腫瘤，其侵及范圍廣，早期復發(fā)，預后極差，死亡率高，近些年發(fā)病率逐漸上升[1-3]。盡管目前標準化療對NHL的有效率較高[4]，但不良反應大，復發(fā)率高，且再治療緩解率低，緩解時間短，損傷骨髓造血系統(tǒng)與免疫功能。作者所在的課題組前期研究[5]發(fā)現(xiàn)，魚腥草揮發(fā)油(volatile oil from houttuyniae herba，HHO)對人Burkitt淋巴瘤Raji細胞有明顯的增殖抑制作用。目前對魚腥草抗腫瘤作用的研究多集中在魚腥草提取物上[6-8]，對HHO抗腫瘤作用的研究較少。該研究以Raji細胞為研究對象，觀察HHO對Raji細胞增殖及凋亡的影響，以期為HHO在惡性淋巴瘤治療方面的研究與應用提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料Raji細胞株購自中國科學院上海細胞庫，HHO由作者所在的實驗室采用水蒸氣蒸餾法提取自魚腥草干品(原藥材購自四川江油，并經(jīng)河南中醫(yī)藥大學藥學院生藥學科董誠明教授鑒定)。RPMI 1640培養(yǎng)基購自北京索萊寶生物醫(yī)藥科技有限公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，MTT購自美國Sigma公司，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒和DNA含量檢測試劑盒(細胞周期)購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，順鉑注射液購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，注射用硫酸長春新堿(簡稱長春新堿)購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司。

1.2HHO溶液的配制取HHO溶于DMSO制成體積分數(shù)50%的母液，加入含體積分數(shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基,逐級稀釋至目標濃度。

1.3MTT法檢測細胞增殖取96孔板，設給藥組、陽性對照組和陰性對照組，每孔接種對數(shù)生長期的Raji細胞混懸液100 μL，細胞數(shù)(9～10)×103/孔；給藥組分別加入1.2中配制的HHO溶液100 μL，使HHO最終體積分數(shù)(10-3)分別為0.500 00、0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.031 25；陽性對照組分別加入順鉑和長春新堿溶液各100 μL，使終質(zhì)量濃度均為10 mg/L；陰性對照組加入等體積的培養(yǎng)基，每組均設3個復孔。將96孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中，于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2條件下培養(yǎng)24、48 和72 h后，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出96孔板，3 000 r/min離心25 min， 吸棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，置于氣浴恒溫振蕩器中37 ℃振蕩10 min，使結晶物充分溶解。使用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長下檢測各孔的吸光度(A)值，計算細胞增殖抑制率(1-給藥組或陽性對照組A值/陰性對照組A值×100%)。再以藥物濃度為橫坐標，以細胞增殖抑制率為縱坐標，作劑量-效應曲線，擬合回歸方程，計算藥物對細胞的IC50。實驗重復3次。

1.4Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡取50 mL細胞培養(yǎng)瓶，設置給藥組和陰性對照組，每瓶接種1×106mL-1的細胞混懸液3 mL；給藥組分別加入不同體積分數(shù)的HHO溶液3 mL，使藥物最終體積分數(shù)(×10-3)分別為0.05、0.10、0.15、0.20；陰性對照組加入等體積的培養(yǎng)基。混勻后，于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。將各組細胞1 000 r/min離心5 min后棄去上清，PBS洗2次，收集(1～5)×105個細胞，加入500 μL的Binding Buffer重懸細胞后加入5 μL Annexin V-FITC混勻，最后加入5 μL PI，混勻、室溫避光反應5～15 min。在染色后1 h 內(nèi)采用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm。計算細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.5PI單染法檢測細胞周期取50 mL細胞培養(yǎng)瓶，設置給藥組和陰性對照組，每瓶接種1×106mL-1的細胞混懸液3 mL；給藥組分別加入不同體積分數(shù)的HHO溶液3 mL，使藥物最終體積分數(shù)(×10-3)分別為0.05、0.10、0.15；陰性對照組加入等體積的培養(yǎng)基?；靹蚝笥?7 ℃、體積分數(shù)5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。將各組細胞1 000 r/min離心5 min后棄去上清，PBS洗1次，收集并調(diào)整細胞密度為1×106mL-1；取1 mL單細胞懸液，離心去上清后，向細胞中加入體積分數(shù)為70%的冷乙醇500 μL，4 ℃固定過夜并保存。將固定后的細胞1 000 r/min離心5 min后棄去上清，PBS洗1次，加100 μL的RNase A重懸后，37 ℃水浴30 min，再加入400 μL PI染液混勻，4 ℃避光30 min。將染色后的細胞上機檢測，記錄激發(fā)波長488 nm處的紅色熒光，分析細胞周期分布情況。實驗重復3次。

1.6統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較不同組間細胞增殖抑制率、細胞凋亡率以及細胞周期分布的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1HHO對Raji細胞增殖的影響見表1。HHO作用24、48和72 h對Raji細胞的IC50(體積分數(shù)/×10-3)分別為0.125 80、0.099 58和0.105 22。作用時間相同時，在一定范圍(體積分數(shù)≤0.250 00×10-3)內(nèi)，隨HHO體積分數(shù)的增加，細胞增殖抑制率呈升高的趨勢。

表1　各組Raji細胞的增殖抑制率(n=3)　%

2.2HHO對Raji細胞凋亡的影響體積分數(shù)(×10-3)分別為0.00(陰性對照組)、0.05、0.10、0.15和0.20的HHO誘導Raji細胞48 h的凋亡率分別為(3.27±0.74)%、(13.10±0.82)%、(33.33±3.50)%、(55.53±0.90)%和(75.23±0.87)%，隨著HHO體積分數(shù)的增加，細胞凋亡率呈升高的趨勢(F=878.629，P<0.001)。

2.3HHO對Raji細胞周期的影響見表2。隨HHO體積分數(shù)的增加，Raji細胞G0/G1期細胞比例有升高的趨勢，S期和G2/M期細胞比例則呈降低的趨勢。

表2　HHO誘導48 h對Raji細胞周期的影響(n=3)　%

3討論

淋巴瘤是我國常見的十大惡性腫瘤之一，每年新發(fā)淋巴瘤患者約8.4萬，死亡人數(shù)超過4.7萬，并以每年5%的速度上升，其中約九成患者罹患NHL，其惡性程度更高，預后更差。目前常用的化療藥物雖治療效果明顯，但常伴有嚴重的不良反應[9-10]。

與普通化療藥相比，中藥多成分多靶點，可以作用于腫瘤發(fā)病的不同環(huán)節(jié)[11-12]，并且具有毒性低、不易產(chǎn)生耐藥、可提高機體免疫力、使患者生存質(zhì)量更高等特點，近年來在抗腫瘤新藥開發(fā)領域，具有抗腫瘤作用的中藥及其有效成分得到了越來越多的關注。

魚腥草為三白草科蕺菜屬植物蕺菜的新鮮全草或干燥地上部分，味辛，性微寒，歸肺經(jīng)，有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋等功效[13]。作者所在的實驗組采用水蒸氣蒸餾法提取HHO并優(yōu)化了提取工藝[14]，采用氣-質(zhì)聯(lián)用技術從HHO中分離鑒定出29個主成分，并利用偏最小二乘回歸分析法對不同產(chǎn)地HHO GC-MS特征峰與Raji細胞增殖抑制率進行了譜效關系分析，結果表明HHO抗淋巴瘤的有效成分組包括對傘花烴、(-)-4-萜品醇、2,4,6-三甲基苯甲醇、甲基正壬酮、十一醇、正癸酸、乙酸香葉酯、2-十二烷酮和石竹烯，其對Raji細胞的抑制作用應為這些物質(zhì)協(xié)同作用的結果[15]。

該研究結果表明，HHO能夠有效抑制Raji細胞的增殖，誘導細胞凋亡，填補了HHO抗腫瘤研究方面的空白，為其在治療NHL方面的研究及應用提供了參考。細胞周期檢測結果顯示，Raji細胞經(jīng)HHO處理后細胞周期被阻滯于G0/G1期，提示HHO誘導Raji細胞凋亡的機制可能與阻滯細胞周期G1/M轉化、抑制細胞中DNA合成和有絲分裂有關，然而細胞周期調(diào)控機制涉及多個環(huán)節(jié)[16-18]，HHO具體作用于哪些環(huán)節(jié)，還需進一步探索研究。

參考文獻

[1]SIDDIQI T,ROSEN ST.Novel biologic agents for non-Hodgkin lymphoma and chronic lymphocytic leukemia-part 1[J].Oncology(Williston Park),2015,29(3):198

[2]GOLDMAN S,SMITH L,GALARDY P,et al.Rituximab with chemotherapy in children and adolescents with central nervous system and/or bone marrow-positive Burkitt lymphoma/leukaemia: a Children's Oncology Group Report[J].Br J Haematol,2014,167(3):394

[3]孫曉菲,甄子俊,夏奕,等.改良NHL-BFM-90方案治療兒童及青少年伯基特淋巴瘤和彌漫大B細胞淋巴瘤的遠期療效[J].中華血液學雜志,2013,34(12):1032

[4]賈存東,趙兵,古力克孜·吾守爾,等.大劑量BEAC方案聯(lián)合自體外周血干細胞移植治療非霍奇金淋巴瘤臨床分析[J].中華腫瘤防治雜志,2013,20(21):1665

[5]張壯麗，鄭立運，趙志鴻，等．魚腥草有效部位及其提取方法和應用：ZL201310045165.6[P].2014-04-24.

[6]劉金娟,楊成流,陳永強,等.魚腥草地下莖提取物誘導胃癌細胞SGC-7901凋亡機制的研究[J].中國藥理學通報,2014,30(2):257

[7]PROMMABAN A,KODCHAKORN K,KONGTAWELERT P,et al.Houttuynia cordata Thunb fraction induces human leukemic Molt-4 cell apoptosis through the endoplasmic reticulum stress pathway[J].Asian Pac J Cancer Prev,2012,13(5):1977

[8]薛興陽,付騰飛,邵方元,等.魚腥草總黃酮對人腫瘤細胞的抗腫瘤活性作用[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志,2013,22(23):2509

[9]陸德珉. 非霍奇金淋巴瘤的臨床研究[D].杭州：浙江大學,2015.

[10]張艷,程旭芳,黃剛,等.新型核苷類似物FNC對Raji細胞增殖、凋亡和Bcl-6、PRDM1、C-myc表達的影響[J].鄭州大學學報(醫(yī)學版),2013,48(4):450

[11]王芳,徐勤.中藥揮發(fā)油誘導腫瘤細胞凋亡作用機制的研究進展[J].中國藥房,2014,25(15):1424

[12]劉偉橋,于澎.中藥黃酮類化合物的抗腫瘤機制[J].長春中醫(yī)藥大學學報,2015,31(2):254

[13]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(一部)[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[14]張壯麗,趙寧,趙志鴻,等.魚腥草揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化[J].中國醫(yī)藥科學,2015,5(1):82

[15]張壯麗,趙寧,趙志鴻,等.魚腥草揮發(fā)油抗淋巴瘤細胞譜效關系[J].鄭州大學學報(醫(yī)學版),2015,50(3):378

[16]PISU M,CONCAS A,CAO G. A novel quantitative model of cell cycle progression based on cyclin-dependent kinases activity and population balances[J].Comput Biol Chem,2015,55:1

[17]HE X,XIANG H,ZONG X,et al.CDK2-AP1 inhibits growth of breast cancer cells by regulating cell cycle and increasing docetaxel sensitivity in vivo and in vitro[J].Cancer Cell Int,2014,14(1):130

[18]戴翠萍,張徐寧,薛彩萍,等.羥基喜樹堿脂質(zhì)體與順鉑聯(lián)用對耐順鉑的人食管癌Eca109細胞周期和凋亡的影響[J].鄭州大學學報(醫(yī)學版),2014,49(3):301

(2015-10-16收稿責任編輯徐春燕)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.04.010

中圖分類號R965

關鍵詞魚腥草揮發(fā)油；Raji細胞；凋亡；細胞周期

Effect of volatile oil from houttuyniae herba on proliferation and apoptosis of Raji cells

ZHANG Zhuangli1)，ZHAO Ning2)，WANG Yafei3)，ZOU Min1)，ZHAO Zhihong1)，ZHANG Xiaojun1)，WANG Guifang1)

1)MedicinalChemistrySection,HenanAcademyofMedicalandPharmaceuticalSciences,Zhengzhou4500522)DepartmentofMedicineServices,theSixthPeople′sHospitalofZhengzhou,Zhengzhou4500013)CollegeofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

Key wordsvolatile oil from houttuyniae herba；Raji cell；apoptosis；cell cycle

AbstractAim: To investigate the effect of volatile oil from houttuyniae herba(HHO) on the proliferation and apoptosis of Raji cells.Methods: Different volume fraction of HHO was used to treat Raji cells for 24，48 and 72 h;the prolifera tion of Raji cells was determined by MTT assay.Different volume fraction of HHO was used to treat Raji cells for 48 h; the cell apoptosis rate was measured by Annexin V-FITC/PI double staining method，and the cell cycle was observed by PI staining method.Results: The MTT results showed that IC50(V/V) of HHO for 24，48 and 72 h treatment was 0.125 80×10-3，0.099 58×10-3and 0.105 22×10-3；with the increase of volume fraction，the inhibitory effect and apoptosis rate showed a rising trend(P<0.05).The results of cell cycle detection showed that HHO was able to arrest Raji cells in G0/G1 phase.Conclusion: HHO could significantly inhibit the proliferation of Raji cells and induce cell apoptosis,and the mechanism may be related to HHO′s blocking G1/M conversion of Raji cells.

*河南省重點科技攻關計劃項目142102310433；河南省自然科學基金資助項目152300410159；河南省省屬科研單位社會公益項目預研專項2013，2014

*：與順鉑組和長春新堿組比較，P<0.05；#：不同體積分數(shù)的HHO組間除0.250 00×10-3和0.500 00×10-3組外，其他組間兩兩比較，P均<0.05。

*：與陰性對照組比較，P<0.05；#：與0.05×10-3HHO組相比，P<0.05；△：與0.10×10-3HHO組相比，P<0.05。