袁文聲，易　峰

(廣東省中山市中心血站　528400)

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IgA缺乏癥獻(xiàn)血者酶聯(lián)免疫試驗(yàn)篩查方法的建立*

袁文聲，易峰

(廣東省中山市中心血站528400)

摘要:目的建立適合用于大規(guī)模IgA缺乏癥獻(xiàn)血者篩選的ELISA檢測(cè)方法。方法采用間接酶聯(lián)免疫法，在微孔板中包被羊抗人IgA、用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗人IgA抗體作為酶標(biāo)二抗。結(jié)果建立的ELISA測(cè)定法靈敏度為0.1 μg/mL，IgA濃度為0.1、100 μg/mL的批間變異系數(shù)(CV)是1.74%、3.49%，批間CV中位數(shù)為3.48%(范圍：1.83%～6.96%)。檢測(cè)過(guò)程約80 min。結(jié)論成功建立了IgA缺乏癥篩查的ELISA測(cè)定法，其靈敏度高、特異度強(qiáng)、省時(shí)、操作簡(jiǎn)易，可用于大規(guī)模篩選IgA缺乏癥獻(xiàn)血者及建立IgA缺乏獻(xiàn)血者庫(kù)。

關(guān)鍵詞:IgA；酶聯(lián)免疫試驗(yàn)；IgA缺乏；獻(xiàn)血者

選擇性IgA缺乏癥是指血清IgA低于0.05 g/L或缺失，而IgG和IgM血清濃度正常，是免疫缺陷中最常見(jiàn)的類型[1]。IgA缺乏癥患者接觸外來(lái)抗原免疫刺激后，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生抗IgA抗體，當(dāng)輸注含IgA的血液或血制品時(shí)可引起嚴(yán)重過(guò)敏性休克反應(yīng)，因此可選擇性輸注IgA缺乏獻(xiàn)血者的血液制品。迄今為止中國(guó)人群健康獻(xiàn)血者中IgA缺乏癥患者的大規(guī)模篩查鮮有報(bào)道，在血站日常的獻(xiàn)血樣本篩選中，并無(wú)IgA缺乏癥的專項(xiàng)檢測(cè)，所以中國(guó)人群IgA缺乏癥患者的輸血存在潛在隱患。本研究擬建立靈敏度高、特異度強(qiáng)，尤其是高通量的ELISA法，用于大規(guī)模的獻(xiàn)血者篩查，建立IgA缺乏癥獻(xiàn)血者庫(kù)。

1材料與方法

1.1儀器與試劑96孔平底微板(Grerner，德國(guó))，水浴箱(德國(guó)JULABO,SW22)，酶標(biāo)儀(安圖Phomo)，微量加樣器(安圖Lisa)，鼠抗人IgA單克隆抗體(SBA，美國(guó))，人標(biāo)準(zhǔn)血清(Athens Research & Technology，美國(guó))，辣根過(guò)氧化酶羊抗人IgA抗體(SBA，美國(guó))，濃縮包被緩沖液(Thermo Scientific，美國(guó))，封閉液(Thermo Scientific，美國(guó))，底物顯色液TMB(Thermo Scientific，美國(guó))，終止液(上海迪申生物)，20×PBS緩沖液(上海迪申生物)，吐溫Tween-20(上海思吉)。

1.2方法

1.2.1包被微板用包被緩沖液(pH9.6，0.05 mmol/L碳酸鹽緩沖液)將鼠抗人IgA抗體以1∶1 000稀釋，每孔加入100 μL，用封口膜封板，輕輕震蕩混勻，置于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜；次日每孔加入0.05%T-PBS(由20×PBS和吐溫Tween-20配制而成，吐溫質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%)300 μL/孔，洗滌3次，扣干后加入200 μL/孔封閉液；將微孔板置于37 ℃水浴箱孵育，30 min后取出，重復(fù)洗板3次。待板扣干后密封存于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2加標(biāo)準(zhǔn)品和樣品血清先將人標(biāo)準(zhǔn)血清稀釋成1、10、102、103、104共4個(gè)濃度梯度，最終濃度從高至低分別為100、10、1、0.1、0.01 μg/mL。加入到96孔板中縱向相應(yīng)位置,每孔100 μL； 將血清樣本作1∶100稀釋后加100 μL到96孔板中縱向相應(yīng)位置，(37±1)℃培養(yǎng)30 min。6次洗板后，向每個(gè)微孔中添加在1/4 000洗滌液稀釋的100 μL辣根過(guò)氧化酶偶聯(lián)二抗，并在37 ℃下培養(yǎng)30 min。洗板6次后，加100 μL/孔底物顯色液TMB，并在22 ℃下的黑暗中孵育20 min。加入50 μL的4N硫酸終止反應(yīng)，測(cè)定每孔在492 nm下的吸光度(OD)，設(shè)定參考波長(zhǎng)為620 nm。吸光度值均按照樣品空白校正，其中包括人類IgA缺乏血漿。為了實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化，通過(guò)稀釋IgA缺乏人類血漿制備的參考IgA獲得已知濃度的IgA。每個(gè)IgA稀釋液都按照上述描述經(jīng)過(guò)了6次處理，并且計(jì)算了平均，標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)，關(guān)于平均值的99%可信區(qū)間(CI)，OD的變異系數(shù)(CV)。

2結(jié)果

2.1ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線及評(píng)測(cè)評(píng)估使用對(duì)照IgA制備物的稀釋液，制作了與OD到IgA濃度有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)化和檢測(cè)靈敏度A標(biāo)準(zhǔn)曲線。IgA濃度的OD為0.01 μg/mL，與IgA缺乏血漿的OD重疊。相比之下，IgA濃度為0.1 μg/mL的平均OD周圍的99%CI的下限，是IgA缺乏血漿平均值99%CI上限的3.1倍。因此，檢測(cè)靈敏度為0.1 μg/mL，因?yàn)檫@是能與空白明顯區(qū)分的最低IgA濃度。

2.2ELISA精確性、靈敏度和重復(fù)性IgA濃度在0.1 μg/mL和100 μg/mL范圍內(nèi)的批內(nèi)檢測(cè)CV從1.74%到3.49%變化，見(jiàn)表1。通過(guò)分析6次檢測(cè)中正常獻(xiàn)血者的20個(gè)樣品，評(píng)估了批間檢測(cè)CV。OD的批間檢測(cè)CV中位數(shù)為3.48%(范圍：1.83%～6.96%)，見(jiàn)表2。

表1　　不同濃度的IgA標(biāo)準(zhǔn)人血清在波長(zhǎng)450 nm處對(duì)應(yīng)的OD和CV值

注：OD為450 nm波長(zhǎng)處重復(fù)3孔的平均值。

表2　　20例正常獻(xiàn)血者IgA檢測(cè)的OD和CV值

注：OD為450 nm波長(zhǎng)處重復(fù)3孔的平均值。

2.3ELISA高劑量鉤狀效應(yīng)為了測(cè)試因獻(xiàn)血者血漿的高IgA水平導(dǎo)致假陰性結(jié)果的可能性(高劑量鉤狀效應(yīng))，本研究對(duì)人體單克隆IgA倍比稀釋，最終IgA濃度范圍是6.8～96.7 μg/mL。在所有情況下，OD值仍很高，證明該檢測(cè)不具有高劑量鉤狀效應(yīng)傾向。

3討論

研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)IgA缺乏的患者血漿中含有IgA抗體，這類個(gè)體在接受含有IgA血液成分時(shí)，可能會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的過(guò)敏性反應(yīng)，雖然該過(guò)敏性反應(yīng)的頻率僅為1∶20 000～1∶47 000名受血者之間，但也成了最常見(jiàn)的非溶血性輸血相關(guān)病死率原因之一[2-4]。故此血漿中含抗IgA的患者應(yīng)接受低IgA的血液成分，最理想的是含有IgA<0.5 μg/mL的血液成分。

對(duì)于這類含IgA抗體的IgA缺乏患者輸血治療一般有3種方法[5]：自體血液輸注；采用經(jīng)多次洗滌后的紅細(xì)胞或血小板；輸注IgA缺乏獻(xiàn)血者的血液成分。自體血液輸注對(duì)于失血過(guò)多的患者不可行，而通過(guò)反復(fù)洗滌細(xì)胞可以獲得低IgA紅細(xì)胞和血小板，然而操作繁瑣、耗時(shí)費(fèi)力，且對(duì)于高度致敏受血者是不夠的，同時(shí)不適合那些需要輸注血漿或冷沉淀的患者，故此輸注IgA缺乏獻(xiàn)血者的血液成分似乎是更好的選擇。

已報(bào)道的對(duì)IgA缺乏的檢測(cè)方法有放射免疫擴(kuò)散法、免疫比濁法、放射免疫、被動(dòng)凝集抑制試驗(yàn)等[6-8]。放射免疫擴(kuò)散、免疫比濁法和放射免疫的靈敏度很低，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，無(wú)法輕易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，或者需要昂貴的儀器。被動(dòng)凝集抑制試驗(yàn)用于某些血站篩選IgA缺乏的獻(xiàn)血者。這個(gè)試驗(yàn)的一個(gè)優(yōu)勢(shì)，是可以適應(yīng)自動(dòng)化設(shè)備，靈敏度在0.5 μg/mL左右，并且檢測(cè)時(shí)間較短，然而該試驗(yàn)需要繁復(fù)的紅細(xì)胞包覆步驟，以及相對(duì)專業(yè)的技能，才能得到滿意的效果。此外，若獻(xiàn)血者血清中存在抗紅細(xì)胞抗體，容易發(fā)生假陽(yáng)性反應(yīng)[9]。因此，上述方法應(yīng)用于大規(guī)模人群篩查IgA缺乏癥時(shí)有局限性，而ELISA法由于其靈敏度高、特異度強(qiáng)尤其是高通量的優(yōu)點(diǎn)適用于大規(guī)模的人群篩選，但是相關(guān)報(bào)道中仍存在需要改進(jìn)的地方。本研究擬建立靈敏度高、特異性強(qiáng)尤其是高通量的ELISA檢測(cè)法，用于大規(guī)模的獻(xiàn)血者篩選，建立IgA缺乏癥獻(xiàn)血者庫(kù)。

本研究建立的ELISA靈敏度水平，與那些報(bào)道的類似測(cè)定法相比，也毫不遜色，其范圍為0.5～5 μg/mL，低于IgA缺乏血液成分提出的0.5 μg/mL閾值的5倍[7-8,10]，精度也令人滿意，因?yàn)樵跍y(cè)定法靈敏度極限中IgA濃度CV僅為3.49%，而對(duì)于批間重復(fù)性評(píng)估，CV都低于6.96%。對(duì)IgA缺乏獻(xiàn)血者進(jìn)行了明確區(qū)分，因?yàn)檎：虸gA缺乏樣品之間OD的差異約為105倍。理論上，因?yàn)猷徔孜廴?，可能?dǎo)致一些IgA缺乏癥獻(xiàn)血者未被發(fā)現(xiàn)。然而，不同微孔板中反復(fù)測(cè)定IgA缺乏癥患者血清標(biāo)本，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)污染；另外，因“高劑量鉤狀效應(yīng)(抗原抗體比例不合適而導(dǎo)致假陰性的現(xiàn)象)”造成的檢測(cè)錯(cuò)誤也是不可忽視的，即把IgA血清水平異常高當(dāng)成IgA缺乏，這一作用在一步夾心法中發(fā)生，原因?yàn)檫^(guò)量的被測(cè)物與固相蛋白及標(biāo)記蛋白爭(zhēng)相結(jié)合，難以或不能有效地形成夾心結(jié)合物，使強(qiáng)陽(yáng)性標(biāo)本誤測(cè)為弱陽(yáng)性甚至假陰性結(jié)果[11]。高劑量鉤狀效應(yīng)在兩步法檢測(cè)中是非常罕見(jiàn)的，本研究測(cè)試了IgA濃度非常高的樣品后，發(fā)現(xiàn)OD值仍很高，證明該檢測(cè)不具有高劑量鉤狀效應(yīng)傾向。

本研究中的96孔測(cè)試板可以通過(guò)使用自動(dòng)樣品處理儀來(lái)制備，用于分配包被抗體，洗滌和封閉試劑。此外，微孔板可以冷凍存儲(chǔ)，性能上沒(méi)有任何損失，至少可存貯存3個(gè)月。因此，在處理便利性，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性方面，它可以與一個(gè)商用的試劑盒媲美。本研究建立的ELISA法在試劑成分、實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)時(shí)間、靈敏度上都作了優(yōu)化和改進(jìn)，并做了質(zhì)控陰性對(duì)照和空白對(duì)照使實(shí)驗(yàn)更符合標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范，與文獻(xiàn)報(bào)道采用的其他方法相比，解決了檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、對(duì)實(shí)驗(yàn)人員有危害等不足之處。

綜上所述，本研究建立的方法與已有技術(shù)相對(duì)照,其效果是積極和明顯的。由于快速、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、檢測(cè)數(shù)量大，本方法可以應(yīng)用于臨床醫(yī)療單位及血站的常規(guī)血液檢測(cè)，為IgA缺乏癥患者減少輸血風(fēng)險(xiǎn)，提高了輸血的安全性，接下來(lái)利用已建立的這種可靠的方法進(jìn)行中國(guó)漢族健康獻(xiàn)血者的缺乏篩查。

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* 基金項(xiàng)目：廣東省中山市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015B1251)。

作者簡(jiǎn)介：袁文聲，女，副主任醫(yī)師，主要從事臨床輸血與檢驗(yàn)研究。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.14.020

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)14-1951-03

(收稿日期：2016-01-11修回日期：2016-03-22)

Establishment of ELISA screening method in blood donors with IgA deficiency*

YUANWensheng,YIFeng

(ZhongshanMunicipalBloodCenter，Zhongshan,Guangdong528400,China)

Abstract:ObjectiveTo establish the enzyme-linked immuno sorbent assay(ELISA) method for a large-scale screening of IgA deficiency in blood donors.MethodsThe indirect ELISA was adopted.The goat anti-human IgA antibody was coated in microwell plates and labeled by horse radish peroxidase (HRP) as enzyme-labelled secondary antibody.ResultsThe sensitivity of established ELISA detection method was 0.1 μg/mL.The intraassay coefficients of variation (CV) for IgA concentrations of 0.1,100 μg/mL were 1.74% to 3.49%.The median interassay CV was 3.48%(range:1.83%-6.96%).The assay process was 80 min.ConclusionThe ELISA detection method is successfully established with high sensitivity,strong specificity,timesaving and easy operating and can be used for a large scale screening of Ig A deficiency and establishment of blood donors bank of Ig A deficiency.

Key words:IgA；enzyme immunoassay；IgA deficiency；blood donor