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        阻斷白介素-3減輕膿毒血癥小鼠的炎癥反應(yīng)

        2016-08-10 06:06:03許白葉張靜王清海梁世山陳真王海島
        關(guān)鍵詞:膿毒血癥中性粒細(xì)胞單核細(xì)胞

        許白葉,張靜,王清海,梁世山,陳真,王海島

        (1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院 兒科,福建 泉州 362000;2.福建泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校,福建 泉州 362000)

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        論著

        阻斷白介素-3減輕膿毒血癥小鼠的炎癥反應(yīng)

        許白葉1,張靜2,王清海1,梁世山1,陳真1,王海島1

        (1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院 兒科,福建 泉州 362000;2.福建泉州醫(yī)學(xué)高等??茖W(xué)校,福建 泉州 362000)

        摘要:目的探究阻斷白介素-3(IL-3)對(duì)膿毒性小鼠炎癥反應(yīng)的作用及其潛在機(jī)制。方法小鼠盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)(CLP)后,分為野生型小鼠組和IL-3缺陷型小鼠組,每組13只,連續(xù)7 d觀察和記錄小鼠的死亡數(shù)。另取野生型小鼠和IL-3缺陷型小鼠,每組20只,分為3組進(jìn)行實(shí)驗(yàn):①組小鼠分別在CLP后0、12和24h進(jìn)行臨床癥狀評(píng)分和體溫測(cè)量;另在24h測(cè)血壓,采血,用于測(cè)定干擾素-α(IFN-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)水平;②組小鼠分別在CLP后0、6、12和24 h采血并在24 h取材(肝、肺),用于測(cè)定中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞總數(shù)及病理、免疫組織化學(xué)分析;③組小鼠分別在CLP后0和24h采血并收集支氣管肺泡灌洗液用于蛋白總量和生化指標(biāo)[天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)]的測(cè)定。結(jié)果與野生型小鼠組比較,CLP后IL-3缺陷型小鼠的存活率和體溫升高(P<0.05),血壓良好,臨床癥狀評(píng)分下降(P<0.05)。此外,與野生型小鼠組比較,CLP后IL-3缺陷型小鼠炎癥細(xì)胞因子IFN-α、IL-1β和IL-6水平降低(P<0.05);肺和肝組織中的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞總數(shù)降低(P<0.05);支氣管肺泡灌洗液中的總蛋白和血生化指標(biāo)(AST、ALT)也降低(P<0.05)。結(jié)論 阻斷IL-3能夠減輕膿毒性小鼠的炎癥反應(yīng),提高膿毒性小鼠的存活率。

        關(guān)鍵詞:膿毒血癥;盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù);中性粒細(xì)胞;單核細(xì)胞;支氣管肺泡灌洗液;干擾素-α

        膿毒血癥是指由病原微生物感染引起的并對(duì)宿主產(chǎn)生危害及不可控的全身炎癥反應(yīng)綜合征(sys temic inflammatory response syndrome,SIRS),導(dǎo)致多個(gè)器官衰竭,具有發(fā)病率高、病情發(fā)展迅速、臨床死亡率高(30%~70%)的特點(diǎn),全球每年有超過1 800萬(wàn)例的嚴(yán)重膿毒血癥患者。

        盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)(cecal ligation and puncture,CLP)最廣泛用于嚙齒類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性膿毒血癥模型,目前被認(rèn)為是膿毒血癥研究的黃金標(biāo)準(zhǔn)[1-4]。由于盲腸是病原菌感染的內(nèi)在來源,CLP后,穿孔的盲腸將導(dǎo)致病原菌性腹膜炎,并且引發(fā)混合的腸原桿菌轉(zhuǎn)移至血液循環(huán)系統(tǒng)。膿毒血癥發(fā)病初期,菌血癥會(huì)激活全身性炎癥反應(yīng),隨后出現(xiàn)膿毒性休克,多器官功能損傷,最后導(dǎo)致死亡。膿毒血癥在臨床上仍然具有很大挑戰(zhàn),其潛在的病理生理特性還不清楚。

        白介素-3(Interleukin-3,IL-3),又稱多集落刺激因子,是白細(xì)胞介素家族重要成員之一,主要由活化的T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生,IL-3不僅介導(dǎo)白細(xì)胞的產(chǎn)生,增殖和生長(zhǎng),還能促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的定向分化與增殖,并在炎癥反應(yīng)中起著重要作用。白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等骨髓基質(zhì)細(xì)胞能夠產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α(Interferon-α,IFN-α)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白介素-6 (Interleukin-6,IL-6),這些細(xì)胞因子是膿毒性休克的標(biāo)志性炎癥因子[5-7]。研究表明,大多數(shù)膿毒性休克與炎癥細(xì)胞因子增多密切相關(guān),包括IFN-α、IL-1和IL-6[8-9]。盡管炎癥細(xì)胞因子與膿毒血癥有關(guān),但I(xiàn)L-3在膿毒血癥中的作用仍不清楚。

        本研究旨在通過盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)建立小鼠膿毒血癥模型,闡述IL-3在膿毒血癥中的作用及其潛在機(jī)制,尤其是IL-3對(duì)膿毒性小鼠炎癥反應(yīng)的影響,為臨床治療膿毒血癥提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1動(dòng)物

        品系為Balb/c的IL-3基因敲除小鼠,4周齡,購(gòu)買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(合格證號(hào)2014621553276679)。IL-3基因敲除:通過IL-3基因組文庫(kù)構(gòu)建一個(gè)替換型載體替換IL-3的第4個(gè)外顯子(80bp)。采用電穿孔法將此打靶載體轉(zhuǎn)入Balb/c小鼠胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ES細(xì)胞),經(jīng)過篩選得到陽(yáng)性克隆的ES細(xì)胞,并植入假孕的Balb/c小鼠子宮內(nèi),發(fā)育得到雜合子的IL-3基因敲除小鼠。小鼠的性成熟期約為35d,妊娠期約20d。雄雌鼠各1只合籠飼養(yǎng),繁育出的子代為野生型IL-3+/+、雜合子型IL-3+/-和突變純合子型IL-3-/-3種表型。剪取小鼠尾巴末端約0.6 cm,根據(jù)QIAGEN說明書提取DNA,聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)鑒定子代小鼠的基因型。野生型IL-3+/+小鼠作為對(duì)照組,突變純合子型IL-3-/-小鼠作為實(shí)驗(yàn)組,雄性,8~12周齡,體重27~29g。小鼠飼養(yǎng)在無(wú)菌的籠盒內(nèi),每籠5只,動(dòng)物房溫度控制在20~25℃,12h晝/夜循環(huán)照明,動(dòng)物可自由攝取高壓滅菌的水和食物,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用健康指南,所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作都遵守動(dòng)物福利。

        1.2試劑與儀器

        紅細(xì)胞裂解液(美國(guó),BioLegend),磷酸鹽緩沖溶液(phosphatebuffersaline,PBS),anti-CD115(AF598,美國(guó)eBioscience公司),anti-Ly-6G(1A8,美國(guó)Bio Legend公司),生物素標(biāo)記的二抗(美國(guó)Vector Laboratories lnc公司),二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine,DAB)(美國(guó)Dako公司),丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase,ALT) 或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase AST)活性測(cè)定試劑盒(美國(guó)Sigma公司),Bio-Rad蛋白測(cè)定試劑盒(美國(guó)Bio-Rad公司),酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(美國(guó)BD Bioscience公司),酶標(biāo)儀(Model450,美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司),BX-51光學(xué)顯微鏡(日本,Olympus公司),溫度感應(yīng)器(TH212型號(hào),北京鴻鷗成運(yùn)科技有限公司),血壓測(cè)定儀(無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)定儀,RBP-1型號(hào),澳大利亞,ADInstruments),冷凍切片機(jī)(CM1950,德國(guó)LEICA公司)。Image-Pro Plus 5.0形態(tài)學(xué)分析軟件(美國(guó),Media Cybernetics公司)。

        1.3方法

        1.3.1PCR檢測(cè)PCR反應(yīng)引物由上海生物工程有限公司合成。引物1:CTCCAGATCGTTAAGGTGG A位于替換的基因片段,用于檢測(cè)突變型;引物2:GACCCTCTCTGAGGAATAAG位于IL-2基因敲除區(qū)域,用于檢測(cè)野生型;引物3:GTAGGTGGAAATTCTA GCAT作為通用引物。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3min,94℃變性30s,64℃退火45s,72℃延伸45 s,共35個(gè)循環(huán),72℃繼續(xù)延伸2 min。取PCR產(chǎn)物5μl于1.2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析,由引物1和3檢測(cè)出的條帶位于500bp處,為純合子小鼠;由引物2 和3檢測(cè)出的條帶位于324bp處,為野生型小鼠。2條帶均存在的為雜合子小鼠。

        1.3.2小鼠CLP模型的建立所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前8h禁食,可自由飲水。手術(shù)前,動(dòng)物常規(guī)腹部消毒,異氟烷持續(xù)麻醉,取腹部皮膚正中切開約2 cm,打開腹腔輕輕提出盲腸,小心分離其遠(yuǎn)端與大腸系膜,避免損傷腸系膜血管。如盲腸內(nèi)有糞便,可輕輕將其擠向與之相連的結(jié)腸。在盲腸遠(yuǎn)端1/2處用無(wú)菌可吸收的7號(hào)手術(shù)縫合絲線緊緊結(jié)扎,避免形成腸梗塞,用20號(hào)無(wú)菌注射針頭在已結(jié)扎盲腸遠(yuǎn)端中央處貫通穿刺2次,形成4個(gè)穿刺孔,輕輕擠出少量腸內(nèi)物以防止穿刺孔閉合,將盲腸推向腹腔,閉腹,逐層縫合。假手術(shù):僅分離盲腸末端,不進(jìn)行結(jié)扎穿刺,其他所有手術(shù)操作一樣。所有動(dòng)物均在術(shù)后背部皮下注射1 ml生理鹽水,行液體復(fù)蘇治療。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程在室溫環(huán)境下進(jìn)行,術(shù)后小鼠自由飲食飲水。

        1.3.3實(shí)驗(yàn)分組①動(dòng)物生存實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)選取野生型和IL-3缺陷型(IL-3-/-)的Balb/c小鼠各13只,分為野生型組(WT組)和IL-3缺陷型組(IL-3-/-組)。兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行CLP手術(shù)造模,CLP手術(shù)方法參考文獻(xiàn)[10]。首次造模后連續(xù)觀察7 d,記錄小鼠死亡數(shù)。②病理組織學(xué)與蛋白分析。另選取野生型和IL-3缺陷型的Balb/c小鼠各20只,分為兩組:野生型CLP組(WT組)和IL-3缺陷型CLP組(IL-3-/-組)。以前述方法造模,造模后按照以下時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行病理組織學(xué)與蛋白分析。實(shí)驗(yàn)操作:a.0、12和24h的臨床癥狀評(píng)分和體溫測(cè)量;0和24 h測(cè)血壓;24 h后采血,用于后續(xù)炎癥細(xì)胞因子的測(cè)定(每組7~8只)。b.0、6、12和24 h眼眶采血;24 h后取材(肝、肺),用于后續(xù)炎癥細(xì)胞總數(shù)測(cè)定、病理及免疫組織化學(xué)分析(每組6只)。C.0和24h麻醉下眼眶采血和支氣管肺泡灌洗后,收集灌洗液和血清做后續(xù)的蛋白總量和生化指標(biāo)的測(cè)定(每組6只)(0h作為CLP手術(shù)前的時(shí)間)。

        1.3.4血生化指標(biāo)測(cè)定①炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)。將眼眶取血以1∶10稀釋比放入紅細(xì)胞裂解液中除去紅細(xì)胞,與臺(tái)盼藍(lán)1∶1混合,血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。②血清生化指標(biāo)測(cè)定。取5μl血清加入到96孔平底板中,ALT或AST測(cè)試緩沖液調(diào)整體積為50μl,加入100μl反應(yīng)混合液,37℃孵育,酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,根據(jù)吸光度計(jì)算酶的活力。方法參考AST或ALT活性測(cè)定試劑盒說明書。

        1.3.5動(dòng)物形態(tài)學(xué)檢測(cè)①體溫測(cè)量。將溫度感應(yīng)器插入麻醉狀態(tài)的小鼠直腸內(nèi)1.5~2.0 cm,溫度感應(yīng)器頭部涂抹凡士林以減少對(duì)動(dòng)物的傷害,待溫度穩(wěn)定后記錄每只小鼠的體溫?cái)?shù)據(jù),平行測(cè)3次。②血壓測(cè)定。采用尾袖法(tail-cuff plethysmograph,TCP)測(cè)定小鼠的血壓。小鼠放在37℃熱板上,以保持小鼠尾部溫度適宜,連接血壓測(cè)定儀,每只動(dòng)物連續(xù)測(cè)5次,取其平均值作為每只動(dòng)物的收縮壓值。③臨床癥狀評(píng)分。根據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)對(duì)每個(gè)小鼠進(jìn)行臨床癥狀評(píng)分:a.外表:正常,0分;缺乏理毛行為,1分;被毛雜亂,2分;彎腰弓背,3分;眼睛半閉合,4分。b.行為(無(wú)攻擊性):正常,0分;沉郁,1分;少動(dòng)孤立,2分;焦躁不安或非常平靜,3分。c.行為(攻擊性):警覺,0分;無(wú)警覺感,3分。d.呼吸癥狀:呼吸正常,0分;呼吸微弱,1分;呼吸率降低并行腹式呼吸,2分;明顯的腹式呼吸并發(fā)紺,3分。e.脫水狀態(tài):正常,0分;脫水,5分。臨床癥狀總分越高表明動(dòng)物身體狀況越差。

        1.3.6生理功能指標(biāo)檢測(cè)①蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)與免疫組織化學(xué)法。野生型(WT)和IL-3缺陷型(IL-3-/-)的Balb/c小鼠分別在CLP后24h取出肺和肝組織,切一小塊放入盛有最佳切削溫度(opti-mum cutting temperature, OCT)包埋劑的包埋盒中,包埋盒緩慢地放入預(yù)冷的異戊烷液面上,直至OCT包埋劑凝固,取出放入-80℃冰箱冷凍保存。取出冷凍的組織塊,切片機(jī)切6μm厚的薄片,放入預(yù)冷丙酮中固定10 min。將固定好的切片放入PBS中洗滌,HE染色,乙醇脫水,二甲苯透明,封片,鏡檢。另取組織切片,用磷酸鹽緩沖溶液Twen-20(phosphate buffer solution twen-20,PBST)洗滌后,經(jīng)5%BSA室溫孵育封閉1 h,加入anti-CD115和anti-Ly-6G 4℃過夜,加入生物素標(biāo)記的二抗,二氨基聯(lián)苯胺顯色,蘇木精復(fù)染、封片、鏡檢、拍照。BX-51光學(xué)顯微鏡和Image-Pro Plus 5.0形態(tài)學(xué)分析軟件觀察并數(shù)據(jù)分析。②ELISA測(cè)定炎癥細(xì)胞因子。CLP后24h收集血液分離出血清,適當(dāng)稀釋后ELISA試劑盒分析IFN-α、IL-1β和IL-6含量。③支氣管肺泡灌洗液總蛋白測(cè)定。小鼠在1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉下,眼科剪切開頸部皮膚,鈍性分離,暴露氣管,氣管上剪一小口,14 G針頭插入,橡皮筋扎緊,注射器吸取1 ml PBS緩沖液接上針頭,來回抽吸,直至肺部變白。Bio-Rad蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定支氣管肺泡灌洗液總蛋白。

        1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,生存資料數(shù)據(jù)行Kaplan-Meier計(jì)算和Log-rank test分析。兩兩多重比較用Turkey檢驗(yàn),兩組比較用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1子代小鼠基因型鑒定

        其中IL-3-/-有1條帶,大小為500 bp,IL-3+/-有2條帶,分別為500和324 bp,野生型有1條帶為324bp。見圖1。

        2.2阻斷IL-3對(duì)CLP誘導(dǎo)小鼠死亡率的影響

        野生型和IL-3缺陷型小鼠CLP手術(shù)后,連續(xù)觀察7d,記錄小鼠死亡數(shù),結(jié)果顯示,野生型組小鼠手術(shù)后第1天死亡1只,第2天死亡3只,第3天死亡1只,第5天死亡1只,第6天死亡1只,存活率46%(6/13)。IL-3缺陷型小鼠手術(shù)后第3天死亡2只,第6天死亡1只,存活率76%(10/13)。經(jīng)Logrank test分析,IL-3缺陷型小鼠存活率高于野生型小鼠,膿毒性小鼠的生存率明顯提高(χ2=4.182,P= 0.040)。見圖2。

        2.3阻斷IL-3對(duì)CLP小鼠行為、體溫和血壓的影響

        小鼠CLP手術(shù)后0、12和24 h的臨床評(píng)分、體溫,并0和24h血壓結(jié)果中,IL-3缺陷型小鼠CLP手術(shù)后12和24 h的臨床評(píng)分分別為(5.41±3.95)和(6.63±3.56)分,與野生型小鼠的臨床評(píng)分[(18.44± 4.70)和(21.02±5.28)分]比較,分別降低70.88%和68.47%(t=6.005和6.392,P=0.000);體溫分別為(35.77±3.60)和(36.18±1.79)℃,與野生型小鼠的體溫[(28.90±4.32)和(27.57±2.18)℃]比較,升高23.78%和 31.25%(t=3.455和 8.634,P=0.004和 0.000)。野生型小鼠和IL-3缺陷型小鼠CLP手術(shù)后0h的血壓分別為(95.58±2.84)和(95.81±5.12)mmHg;CLP手術(shù)后24h,IL-3缺陷型小鼠的血壓為(91.56± 6.06)mmHg,野生型小鼠血壓低于測(cè)量范圍。見圖3。

        圖1 子代IL-3小鼠PCR鑒定結(jié)果

        圖2 CLP術(shù)后兩組小鼠生存曲線

        2.4阻斷IL-3對(duì)CLP小鼠肺和肝組織炎癥反應(yīng)的影響

        CLP手術(shù)后24 h,IL-3缺陷型小鼠支氣管肺泡灌洗液的總蛋白含量為(0.34±0.28)mg/ml,與野生型小鼠[(0.81±0.18)mg/ml]比較,下降57.82%(t= 3.990,P=0.001);而CLP手術(shù)后0 h,IL-3缺陷型小鼠和野生型小鼠支氣管肺泡灌洗液的總蛋白含量分別為(0.32±0.06)和(0.28±0.13)mg/ml,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.720,P=0.483)。IL-3缺陷型小鼠CLP手術(shù)后24 h,血清中的AST和ALT分別為(1.66± 0.33)IU/ml和(18.86±5.77)IU/ml,比野生型小鼠AST[(2.28±0.62)UI/ml]和ALT[(32.02±15.82)IU/ml]降低27.15%和41.11%(t=2.490和2.211,P=0.026和0.044);而CLP手術(shù)后0 h,IL-3缺陷型小鼠的AST[(0.61±0.39)IU/ml]和ALT[(9.34±4.80)IU/ml]與野生型的AST[(0.34±0.10)IU/ml]和ALT[(12.93± 4.58)IU/ml]比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.931和1.529,P=0.074和0.149)。見表1。

        表1 阻斷IL-3對(duì)CLP小鼠肺和肝組織炎癥反應(yīng)的影響 (n=6±s)

        表1 阻斷IL-3對(duì)CLP小鼠肺和肝組織炎癥反應(yīng)的影響 (n=6±s)

        注:1)與WT組比較,P<0.01;2)與WT組比較,P<0.05

        組別肺泡灌洗液蛋白總量/(mg/ml)AST/(IU/ml)ALT/(IU/ml)24h WT組 0.28±0.13 0.81±0.18 0.34±0.10 2.28±0.62 12.93±4.58 32.02±15.81 IL-3-/-組 0.32±0.06 0.34±0.281) 0.61±0.39 1.66±0.332) 9.34±4.80 18.86±5.772)0h 24h 0h 24h 0h

        HE染色表明,CLP手術(shù)后1d,野生型小鼠的肺組織出現(xiàn)明顯的間質(zhì)性肺炎病理學(xué)特征,肺泡壁增寬,毛細(xì)血管充血擴(kuò)張,嚴(yán)重的可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和肺泡上皮細(xì)胞脫落,肺組織損傷嚴(yán)重;IL-3缺陷型小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少,肺組織損傷較輕。野生型小鼠的肝組織顏色變淺,發(fā)生水腫,肝細(xì)胞壞死,細(xì)胞核裂解,溶解,細(xì)胞體積膨脹,細(xì)胞膜不完整,肝組織損傷嚴(yán)重;IL-3缺陷型小鼠的肝組織結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞較完整。見圖4。

        2.5阻斷IL-3對(duì)CLP小鼠炎癥細(xì)胞的影響

        為檢測(cè)IL-3對(duì)組織和血液中炎癥細(xì)胞的影響,小鼠CLP手術(shù)后0、6、12和24 h采血并在24 h安樂死取肺和肝組織,測(cè)定血液中的炎癥細(xì)胞,并行肺以及肝組織的免疫組織化學(xué)染色,結(jié)果表明,CLP手術(shù)后24 h,IL-3缺陷型小鼠血液中的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞分別為(7.23±3.79)×105/ml和(0.60± 0.28)×105/ml,與野生型小鼠[(13.22±6.86)×105/ml和(1.37±0.65)×105/ml]比較,分別降低1.83和2.29倍(t=3.213和3.063,P=0.015和0.008)。此外,野生型小鼠的單核細(xì)胞在CLP手術(shù)后0和24 h分別(0.52±0.42)×105/ml和(1.37±0.65)×105/ml,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.072,P=0.008)。見表2。

        圖3 阻斷IL-3對(duì)CLP小鼠行為、體溫和血壓的影響

        免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明,小鼠CLP手術(shù)后24 h后,野生型小鼠肺和肝組織存在大量的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞聚集,肺組織的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分別為(5.25±1.79)×106和(1.80±0.87)× 106;肝組織的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分別為(1.23± 0.36)×106和(5.44±4.56)×107;而IL-3缺陷型小鼠肺組織的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分別為(3.44± 0.99)×106和(1.03±1.00)×106;肝組織的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分別為(0.56±0.32)×106和(1.59± 1.63)×107,兩組比較IL-3缺陷型小鼠中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)量減少(t=2.493、2.594、3.940和2.253,P=0.026、0.021、0.002和0.041)。見表3和圖5~7。

        2.6阻斷IL-3對(duì)CLP小鼠炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響

        ELISA檢測(cè)結(jié)果表明,野生型小鼠組中,IL-1β、IL-6和 IFN-α 分別為(412.84±243.23)pg/ml、(37.94±24.49)ng/ml和(139.71±114.18)pg/ml。IL-3缺陷型小鼠組中,IL-1β、IL-6和IFN-α分別為(22.61±6.68)pg/ml、(7.22±5.00)ng/ml和(23.17± 26.95)pg/ml,與野生型小鼠組比較,分別下降95%、81%和83%(t=4.536、3.475和2.810,P=0.001、0.004 和0.014)。見表4和圖8。

        圖4 阻斷IL-3對(duì)CLP小鼠肺和肝組織炎癥反應(yīng)的影響

        圖5 阻斷IL-3對(duì)CLP小鼠肺組織炎癥細(xì)胞的影響

        表2 兩組CLP術(shù)后血液中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞比較 (n=6,×105/ml±s)

        表2 兩組CLP術(shù)后血液中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞比較 (n=6,×105/ml±s)

        注:1)與WT組比較,P<0.05;2)與WT組比較,P<0.01

        組別0h 6h 12h 24h WT組中性粒細(xì)胞 5.62±2.55 8.93±5.58 6.30±3.52 13.22±6.86單核細(xì)胞0.52±0.42 0.49±0.23 0.75±0.42 1.37±0.65 IL-3-/-組中性粒細(xì)胞 6.45±2.74 12.17±3.38 8.93±5.71 7.23±3.791)單核細(xì)胞 0.64±0.42 0.49±0.32 0.46±0.46 0.60±0.282)

        表3 兩組CLP術(shù)后24 h肺及肝組織炎癥細(xì)胞比較 (n=6,×106±s)

        表3 兩組CLP術(shù)后24 h肺及肝組織炎癥細(xì)胞比較 (n=6,×106±s)

        注:1)與WT組比較,P<0.05;2)與WT組比較,P<0.01

        組別肺組織肝組織中性粒細(xì)胞WT組 5.25±1.79 1.80±0.87 1.23±0.36 54.44±45.58 IL-3-/-組 3.44±0.991) 1.03±1.001) 0.56±0.322) 15.88±16.321)單核細(xì)胞中性粒細(xì)胞單核細(xì)胞

        圖6 阻斷IL-3對(duì)CLP小鼠肝組織炎癥細(xì)胞的影響

        圖7 阻斷IL-3對(duì)CLP小鼠血液中炎癥細(xì)胞的影響

        圖8 阻斷IL-3對(duì)CLP小鼠炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響

        表4 兩組CLP后24 h血清炎癥細(xì)胞因子含量比較(n=6±s)

        表4 兩組CLP后24 h血清炎癥細(xì)胞因子含量比較(n=6±s)

        注:1)與WT組比較,P<0.001;2)與WT組比較,P<0.01;3)與WT組比較,P<0.05

        組別TNF-α/(pg/ml)WT組 412.84±243.23 37.94±24.49 139.71±114.18 IL-3-/-組 22.61±6.681) 7.22±5.002) 23.17±26.953)IL-1β/(pg/ml)IL-6/(ng/ml)

        3 討論

        膿毒血癥是由感染引起的,具有免疫與炎癥反應(yīng)的高發(fā)病率和死亡率疾病。炎癥反應(yīng)往往伴隨著炎癥細(xì)胞的激活和多種炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放。許多研究表明,膿毒血癥與大量的炎癥細(xì)胞因子(IFN-α、IL-1和IL-6)產(chǎn)生有關(guān)。這些炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生似乎代表著不受控制的強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)。據(jù)研究報(bào)道,給予這些炎癥細(xì)胞因子可以模仿產(chǎn)生許多膿毒性休克癥狀,包括不良的心血管反應(yīng)[8,11]。給予抗細(xì)胞因子,如IFN-α抗體能夠提高嚴(yán)重膿毒性休克動(dòng)物和人的成活率[12-13]。本研究表明,IL-3缺陷型小鼠組CLP手術(shù)后小鼠的存活率和臨床癥狀表現(xiàn)出明顯的改善,提示IL-3參與膿毒血癥的發(fā)病機(jī)制。WEBER等[14]研究發(fā)現(xiàn),給予健康的野生型小鼠IL-3,可以使其炎癥細(xì)胞數(shù)增加,等同野生型CLP小鼠。相反,給予IL-3受體拮抗劑(Anti-CD123)能夠減少野生型CLP小鼠的炎癥細(xì)胞數(shù)并提高其生存率。研究報(bào)告表明,膿毒血癥患者中的IL-3濃度很高,并伴有高死亡風(fēng)險(xiǎn)[15]。這些研究表明IL-3通過與其受體結(jié)合,可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞的產(chǎn)生,提高膿毒性小鼠的成活率。

        本研究中筆者還發(fā)現(xiàn),與野生型小鼠比較,敲除IL-3能夠降低小鼠肺和肝組織中的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞以及血液中炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和IFN-α的表達(dá)水平。這提示當(dāng)機(jī)體發(fā)生感染,IL-3會(huì)促進(jìn)單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞及免疫細(xì)胞等產(chǎn)生,而這些細(xì)胞會(huì)釋放出大量的炎癥細(xì)胞因子。膿毒血癥是免疫系統(tǒng)對(duì)感染或組織損傷發(fā)生的一種過度反應(yīng),產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子,導(dǎo)致大量的免疫細(xì)胞募集。這些細(xì)胞又會(huì)釋放出更多的細(xì)胞因子,從而又招募更多的免疫細(xì)胞,形成一個(gè)惡性循環(huán)。這些細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞并不會(huì)阻止初始的感染,而是攻擊機(jī)體的組織和器官,導(dǎo)致器官衰竭和死亡。RAUCH等[16]研究表明,IL-3由脾臟、胸腺和淋巴結(jié)中的B細(xì)胞產(chǎn)生,IL-3能導(dǎo)致多種白細(xì)胞的產(chǎn)生和增殖,從而釋放出大量的細(xì)胞因子(被稱為細(xì)胞因子風(fēng)暴)。另有研究顯示,CLP術(shù)后,小鼠產(chǎn)生IL-3的T細(xì)胞和B細(xì)胞數(shù)不同,但嗜堿性細(xì)胞與肥大細(xì)胞數(shù)相差不大,這表明IL-3在炎癥初期對(duì)嗜堿性細(xì)胞和肥大細(xì)胞的產(chǎn)生及功能沒有影響[17-19]。本研究也表明,CLP術(shù)后野生型小鼠的肺和肝組織積累著比IL-3缺陷型小鼠更多的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞,并且支氣管灌洗液中的蛋白也明顯增多。這說明IL-3促進(jìn)膿毒血癥中的炎癥反應(yīng)。ANNANE[20]和WARD 等[21]報(bào)道,IL-3還會(huì)導(dǎo)致膿毒血癥中的膿毒性休克。

        綜上可知,IL-3可以通過增強(qiáng)炎癥反應(yīng)促進(jìn)膿毒血癥的發(fā)生,而阻斷IL-3能夠減輕炎癥反應(yīng),改善膿毒血癥的成活率,這為IL-3成為臨床上治療膿毒血癥的靶點(diǎn)提供研究基礎(chǔ)。

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        (申海菊編輯)

        中圖分類號(hào):R 459.7

        文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

        DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.13.006

        文章編號(hào):1005-8982(2016)13-0028-09

        收稿日期:2015-12-02

        Blockade of IL-3 ameliorates sepsis-induced inflammation in mice

        Bai-ye Xu1,Jing Zhang2,Qing-hai Wang1,Shi-shan Liang1,Zhen Chen1,Hai-dao Wang1
        (1.Department of Pediatrics,Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University,Quanzhou,F(xiàn)ujian 362000,China;2.Quanzhou Medical College,Quanzhou,F(xiàn)ujian 362000,China)

        Abstract:Objective To investigate the effect of blockade of IL-3 on sepsis-induced inflammation in mice and explore its underlying mechanism.Methods Mice in WT group(n=13)and IL-3-/-group(n=13)were observed and mortality was recorded up to 7 days after cecal ligation and puncture(CLP).In addition,more mice were randomly assigned to WT group(n=20)and IL-3-/-group(n=20)after CLP,each group was divided into 3 subgroups for study.In the first subgroup,clinical score assessment and body temperature measurement were conducted at 0,12 and 24 h after CLP;blood pressure was measured and blood was collected to determine the levels of IFN-α,IL-1β and IL-6 by ELISA at 24 h after CLP.In the second subgroup,blood was collected to determine the total number of neutrophils and monocytes at 0,6,12 and 24 h after CLP,and lungs and liver were harvested for histopathological analysis at 24 h after CLP.In the third subgroup,blood and bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were collected to determine total protein content and enzyme activity(AST and ALT)at 0 h,24 h after CLP.Results The survival,body temperature and blood pressure of septic mice in the IL-3-/-group were significantly improved after CLP compared with mice in the WT group(P<0.05).The clinical score of the septic mice in the IL-3-/-group significantly decreased compared with the WT group(P<0.05).In addition,the levels of IL-2 and IFN-γ in the IL-3-/-group significantly decreased compared with the WT group(P<0.05).The total number of neutrophils and monocytes inthe lung and liver tissues of the IL-3-/-group significantly decreased,and the total protein content of BALF and enzyme activity of serum AST and ALT also significantly decreased in the IL-3-/-group compared with the WT group(P<0.05).Conclusions Blockade of IL-3 can improve survival of septic mice through alleviation of sepsis-induced inflammation.

        Keywords:sepsis;cecal ligation and puncture;neutrophil;monocyte;blood and bronchoalveolar lavage fluid;interferon-α

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