米 萱,楊 力,仇利紅,宋雅娟,石 定,陳 琳,蘇映軍

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實驗研究

自噬抑制2-DG誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡

米 萱,楊 力,仇利紅,宋雅娟,石 定,陳 琳,蘇映軍

目的 探討2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG)誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡與自噬及兩者之間的關(guān)系。方法 傳代培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞，在常氧實驗條件下，細胞被分為對照組，不同濃度的2-DG組、2-DG聯(lián)合甘露糖組、陽性對照組(衣霉素組)，利用MTS比色法檢測2-DG對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞增殖活性的影響；利用Western blot免疫印記技術(shù),檢測細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白-葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)的表達水平，以反映處理后的細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的水平變化；以Annexin V-PI流式細胞術(shù)檢測人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞凋亡。為了檢測2-DG對細胞自噬的影響，引入自噬抑制劑3-MA, 采用Western blot 免疫印記技術(shù)，檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin 1和Atg 5的表達水平，以反映處理后的細胞自噬水平變化。結(jié)果 2-DG組細胞增殖活力明顯降低，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義，且該抑制作用呈劑量依賴性；2-DG聯(lián)合甘露糖組增殖活力有所增加，與單獨2-DG組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義；2-DG組凋亡率明顯增加，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義，2-DG聯(lián)合甘露糖組細胞凋亡減少，與單獨2-DG組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義；2-DG組GRP78蛋白水平增加，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義；加入甘露糖后，GRP78蛋白水平減少，與單獨2-DG組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義；2-DG組 Beclin1和Atg5蛋白表達均有所增加，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義；3-MA預(yù)處理細胞抑制自噬后，2-DG誘導(dǎo)的細胞凋亡增多，Beclin1和Atg5蛋白表達也有所減少，與2-DG組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 2-DG顯著抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞增殖，誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞凋亡及自噬；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能是介導(dǎo)2-DG誘導(dǎo)細胞凋亡的相關(guān)作用機制；2-DG誘導(dǎo)的細胞自噬則能抑制細胞凋亡。

2-DG； 人臍靜脈內(nèi)皮細胞； 凋亡； 自噬； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

2-脫氧-D-葡萄糖(2-deoxy-glucose，2-DG)是一種葡萄糖類似物，已有研究證實，2-DG可以抑制多種腫瘤細胞的增殖、分化和遷移，可作為包括肺癌、乳腺癌、骨肉瘤等多種腫瘤化療的輔助用藥，其作為新的抗腫瘤藥物已進入Ⅱ期臨床研究[1]。

研究發(fā)現(xiàn)，2-DG的抗腫瘤作用涉及多個不同機制，其中最經(jīng)典的是其糖酵解抑制作用。 在組織缺氧的情況下， 2-DG能夠和葡萄糖競爭性結(jié)合己糖激酶(HK)，形成的產(chǎn)物不能被6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(PGI)利用轉(zhuǎn)化，而使糖酵解停止，細胞能量“剝奪”，致使細胞死亡。1978年，R Datama等提出了2-DG對蛋白質(zhì)糖基化有干擾作用，此后，眾多研究對該作用的發(fā)生機制進行了驗證[2](M Kurtoglu, 2007年)。研究發(fā)現(xiàn)，2-DG可誘導(dǎo)多個細胞系發(fā)生自噬[3-4]。在眾多的自噬相關(guān)基因中，有兩個重要的基因：Beclin1和Atg5，Beclin1為Atg6的同源類似物，參與自噬小體的形成，介導(dǎo)自噬的起始[5]。Atg5參與了兩個泛素樣連接系統(tǒng)，促進自噬小體的形成(N Mizushima, 2003年)。自2014年1月，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院采用2-DG誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡和自噬， 探討2-DG誘導(dǎo)的凋亡和自噬之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞及主要試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs, 美國SCIENCELL公司)；2-脫氧葡萄糖(2-DG)、3-甲基腺素 (3-MA)、衣霉素(Tunicamycin)、甘露糖(D-mannose)購自美國SIGMA公司；內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液ECM(北京裕恒豐公司)；MTS試劑(美國PROMEGA公司)；凋亡檢測試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)有限公司)；抗人多克隆抗體APG5、抗人多克隆抗體 Beclin1 購自美國SANTA CRUZ公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下的細胞培養(yǎng)箱中,用含10%胎牛血清的ECM培養(yǎng)HUVECs細胞，待細胞達對數(shù)生長期后，用不同濃度的2-DG處理細胞。2-DG與D-mannose聯(lián)合作用組中加入D-mannose，用以部分逆轉(zhuǎn)細胞的N-連接糖基化。2-DG與3-MA聯(lián)合作用組中的3-MA，于2-DG處理前1 h加入，預(yù)處理用以抑制細胞自噬。

1.3 MTS比色分析 用ECM培養(yǎng)液將HUVECs配成單個細胞懸液，接種濃度為1×105/ml，每孔體積100 μl接種于96孔板中。將接種細胞的96孔板置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，對照組為空白對照，2-DG的工作濃度為：實驗2組0.05 mmol/L、3組0.50 mmol/L、4組5.00 mmol/L；5～7組在2～4組的基礎(chǔ)上加入D-mannose，D-mannose的工作濃度為0.50 mmol/L；8組為Tunicamycin組，工作濃度為1 μg/ml，Tunicamycin為N-連接糖基化抑制劑，可以誘導(dǎo)ERS。細胞經(jīng)處理24 h后， 每孔加入20 μl MTS溶液(cell Titer 96 Aqueous One Solution Reagant)，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下孵育4 h后，在酶標儀上分析，設(shè)定讀取波長為570 nm，記錄各孔光密度(OD)值。

1.4 Annexin V-PI流式分析 培養(yǎng)細胞密度達到90%左右，此時細胞處于對數(shù)生長期，收集細胞并計數(shù)后，將細胞接種于6孔培養(yǎng)板，按實驗要求分組鋪板，待細胞貼壁后，加藥處理。將事先配好的4種藥用培養(yǎng)基稀釋，對細胞進行換液加藥。

分組為Control、2-DG 10 mmol/L、2-DG 10 mmol/L+1 mmol/L D-mannose、2-DG 10 mmol/L+2 mmol/L 3-MA、2 mmol/L 3-MA。將接種好的細胞置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后，進行流式檢測。先將細胞離心，轉(zhuǎn)速1500 r/min，5 min后收集細胞，吸去上清液，用PBS洗滌細胞2次，離心，小心吸去上清液，殘留約50 μl的PBS，每管細胞樣品中加入500 μl Binding Buffer輕輕重懸細胞。加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，加入10 μl Propidium Iodide，混勻。室溫避光孵育15 min。隨即上流式機進行檢測。

1.5 Western blot免疫印記實驗 利用Western blot 免疫印跡法檢測細胞的GRP78和Beclin1、Atg5蛋白水平。收集實驗處理過的細胞, 用預(yù)冷的PBS洗滌2次，將室溫融化的裂解液混入體積1%的PMSF，加入相應(yīng)體積的裂解液，置于冰上靜置5 min。于低溫冷凍離心機中離心，4℃，12 000 r/min，離心10 min，分離得到的上清液即為蛋白質(zhì)抽提物。用 BCA 法測定蛋白濃度后，通過蛋白上樣、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育一抗、二抗、 ECL底物發(fā)光、封閉等步驟后，將膠片進行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標條帶的光密度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算出目的條帶的相對光密度值。

2 結(jié)果

2.1 2-DG抑制HUVECs細胞增殖 對照組HUVECs的增殖活力最大，與對照組相比，細胞活力隨著2-DG濃度的增加而逐漸減小，0.05 mmol/L 2-DG處理組只能小幅度抑制HUVECs的活力，5.00 mmol/L 2-DG對HUVECs的抑制作用最為明顯。而5～7組分別在2～4組的基礎(chǔ)上加入D-mannose后，增殖活力分別有所增加，且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。如圖1所示，2-DG能明顯抑制細胞增殖，且其增殖抑制作用呈劑量依賴性，濃度越高，抑制作用越強；而加入了D-mannose后，抑制作用相應(yīng)減弱。

2.2 2-DG促進HUVECs細胞凋亡 將細胞分為Control、2-DG 10 mmol/L、10 mmol/L 2-DG+1 mmol/L D-mannose、10 mmol/L 2-DG+2 mmol/L 3-MA、2 mmol/L 3-MA組。各組藥物作用于HUVEC細胞24 h后，利用Annexin V-FITC/PI雙染色法，檢測藥物作用24 h后HUVEC細胞凋亡。結(jié)果顯示：與對照組相比，2-DG作用組早期凋亡率增多，晚期凋亡細胞及壞死細胞群均明顯增多，加入D-mannose后，早期凋亡率降低，晚期凋亡細胞及壞死細胞群減少。3-MA預(yù)處理組與單純2-DG組相比，早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞均有所增加，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

2.3 2-DG促進HUVECs細胞未折疊蛋白反應(yīng) 將細胞分為Control、2-DG 10 mmol/L、2-DG 5 mmol/L、2-DG10 mmol/L+1 mmol/L D-mannose、2-DG 5 mmol/L+1 mmol/L D-mannose、衣霉素1 μg/ml組進行不同處理。Western blot 免疫印跡結(jié)果顯示，在2-DG的作用下，GRP78蛋白表達水平增多，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；2-DG聯(lián)合D-mannose作用于細胞后，GRP78蛋白表達水平相應(yīng)減少，與單純2-DG實驗組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖3 。

2.4 2-DG誘導(dǎo)HUVECs細胞自噬 將細胞分為Control、2-DG 10 mmol/L、2-DG 5 mmol/L、2-DG 10 mmol/L+2 mmol/L 3-MA、2-DG 5 mmol/L+2 mmol/L 3-MA、2 mmol/L 3-MA組，分別予以不同處理。Western blot檢測分析發(fā)現(xiàn)，以10 mmol/L 2-DG、5 mmol/L 2-DG處理細胞24 h后，Atg5的蛋白水平明顯高于對照組，且與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。加入3-MA預(yù)處理1 h后，再以10 mmol/L 2-DG、5 mmol/L 2-DG處理細胞24 h，Atg5的蛋白水平明顯降低，與單純2-DG實驗組相比，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖4a)。Beclin1蛋白表達水平也呈現(xiàn)出相似的趨勢(圖4b) 。

3 討論

糖酵解抑制劑 2-脫氧葡萄糖對腫瘤細胞具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌細胞系(MiaPaPa2)和乳腺癌細胞系(SKBR3)中，2-DG可以上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白GRP78、GRP94以及CHOP的表達，引發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)，誘導(dǎo)細胞凋亡[2]。在TCL(T細胞型白血病)細胞中，2-DG上調(diào)UPR相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，且甘露糖可以逆轉(zhuǎn)UPR和細胞凋亡，但其對能量剝奪并無明顯的逆轉(zhuǎn)作用[6]。

本實驗中，隨著2-DG濃度的增加，2-DG處理后HUVECs增殖活力逐漸降低，驗證了2-DG的增殖抑制作用。根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果，我們選擇濃度為10 mmol/L的2-DG誘導(dǎo)HUVECs凋亡，結(jié)果顯示，常氧狀態(tài)下，2-DG對細胞的增殖抑制和促進凋亡的作用，可以被外源性的甘露糖逆轉(zhuǎn)。本實驗也發(fā)現(xiàn)，2-DG上調(diào)GRP78 (內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白)的表達，而甘露糖與2-DG聯(lián)合處理細胞后，GRP78表達下調(diào)，與單純2-DG實驗組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，即2-DG可誘導(dǎo)UPR，且可被甘露糖部分逆轉(zhuǎn)。因為甘露糖可以逆轉(zhuǎn)UPR和細胞凋亡，證明2-DG可以通過誘導(dǎo)UPR和ERS，影響細胞生存，也就是說，2-DG誘導(dǎo)的細胞凋亡，很有可能是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡途徑介導(dǎo)的。

研究發(fā)現(xiàn)，2-DG可誘導(dǎo)多個細胞系發(fā)生自噬活化。機制中研究較多的是AMPK途徑。有文獻指出，2-DG通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)自噬[3-4]。在多個細胞系中證實，2-DG可通過ERS誘導(dǎo)AMPK磷酸化[7]。在肺癌細胞系、LNCaP、膠質(zhì)細胞瘤中，證實了2-DG通過激活A(yù)MPK、抑制mTOR、激活自噬[7-8]。

圖1 2-DG對 HUVEC增殖抑制作用及mannose對其部分逆轉(zhuǎn) 圖2 Annexin V-FITC /PI 雙染色法檢測細胞凋亡 圖3 Western blot 檢測GRP78蛋白水平 圖4 Western blot 檢測蛋白水平 a. Atg5. b. Beclin1.
Fig 1 Inhibition of 2-DG on proliferation of HUVECs and partially reversion of mannose on it. Fig 2 Apoptotic cells detected by Annexin V-FITC/PI double staining. Fig 3 The protein level of GRP78 detected by Western blot. Fig 4 The protein level detected by Western blot. a. Atg5. b. Beclin1.

我們發(fā)現(xiàn)，2-DG可以上調(diào)Beclin1和Atg5蛋白表達，證實2-DG能誘導(dǎo)細胞自噬。2-DG可以誘導(dǎo)HUVECs細胞發(fā)生凋亡和自噬，利用公認的自噬抑制劑3-MA抑制自噬后，發(fā)現(xiàn)2-DG誘導(dǎo)的細胞凋亡增加，說明雖然2-DG同時誘導(dǎo)了細胞自噬和凋亡，但自噬可能更多的是抑制細胞凋亡，發(fā)揮細胞保護的作用。由此我們得出結(jié)論，2-DG與自噬抑制劑聯(lián)用可以降低2-DG誘導(dǎo)的自噬活化，增強2-DG對內(nèi)皮細胞的毒性作用。

眾所周知，嬰幼兒血管瘤是以血管內(nèi)皮細胞增生為特征的良性腫瘤。增殖期血管瘤通常表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細胞增殖活躍，我們以HUVECs為研究對象，推測2-DG對血管瘤內(nèi)皮細胞的作用。本課題組的前期實驗發(fā)現(xiàn)，2-DG對HUVECs的生物學(xué)功能有抑制作用[9]，而且對裸鼠皮下移植血管瘤瘤體生長有抑制作用。雖然大量研究證實，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激不但能夠促凋亡，也能夠誘導(dǎo)自噬，但是，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中，自噬和凋亡的轉(zhuǎn)換機制尚不清楚[10]。至于2-DG誘導(dǎo)自噬的相關(guān)分子通路以及自噬和凋亡之間的轉(zhuǎn)換機制，有待下一步研究。

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Autophagy inhibits endothelial cell apoptosis induced by 2-DG

MIXuan,YANGLi,QIULi-hong,SONGYa-juan,SHIDing,CHENLin,SUYing-jun.

(InstituteofPlasticSurgery,XijingHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China)

YANGLi,Email:yangli@fmmu.edu.cn

Objective To explore the autophagy and apoptosis of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) induced by 2-deoxidation-D-glucose (2-DG) and the relationship between them. Methods HUVECs cultured under normoxia conditions were divided into control group, 2-DG group, 2-DG combined with mannose group and positive control group (tunicamycin group). The effects of the proliferation activity of 2-DG on HUVECs were evaluated by MTS assay at 24 hours after culture. The expression level of the Endoplasmic Reticulum Stress (ERS)-related protein, glucose regulated protein 78 (RP78), was detected by Western blot to check the changes of ERS after treatment. The level of HUVECs apoptosis was detected by flow cytometry; the autophagy inhibitor 3-MA was introduced into this experiment so as to detect the effects of 2-DG on cell autophagy, then the expression levels of Beclin1 and Atg5 were detected by Western blot technique to reflect the changes of autophagy after treatment. Results Compared with the control group, the cell proliferation activity of the 2-DG group was significantly decreased, and this inhibition was dose-dependent. Proliferation activity of the 2-DG joint mannose group increased compared with the 2-DG group, with a significant difference. The apoptosis rate of the 2-DG group increased significantly compared with the control group with a significant difference, and the apoptosis rate of the 2-DG joint mannose group decreased significantly compared with the 2-DG group. The GRP78 protein level of the 2-DG group increased, compared with the control group with a significant difference. After adding mannose, the GRP78 protein level reduced significantly, compared with the 2-DG group. Beclin1 and Atg5 protein levels of the 2-DG group increased, as compared with the control group, with a significant difference. After 3-MA pretreatment, the 2-DG-induced apoptosis rate increased, Beclin1 and Atg5 protein expression levels also decreased significantly, compared with the 2-DG group. Conclusion 2-DG significantly inhibited the proliferation of HUVECs and induced HUVECs apoptosis and autophagy. ERS may mediate the cell apoptosis effect of 2-DG. However, autophage may reduce the apoptosis.

2-deoxy-glucose; HUVEC; Apoptosis; Autophagy; Endoplasmic Reticulum Stress

陜西省社會發(fā)展攻關(guān)計劃項目(2014K11-03-09-11)

710032 陜西 西安,第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 全軍整形外科研究所

米 萱(1988-)，女，陜西西安人，住院醫(yī)師，碩士研究生.

楊 力，710032,第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 全軍整形外科研究所，電子信箱:yangli@fmmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.04.017

R329.2

A

1673-7040(2016)04-0242-04

2016-02-10)