任英華，艾紅軍，劉 學(xué)，倪 卓，王 楊，章立群

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實(shí)驗(yàn)研究

PEEK/HA對(duì)成骨細(xì)胞(MG63)增殖分化的影響

任英華，艾紅軍，劉 學(xué)，倪 卓，王 楊，章立群

目的 研究納米PEEK/HA復(fù)合材料對(duì)MG63細(xì)胞相容性的影響。方法 應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù)研究不同組分的復(fù)合材料浸提液中MG63細(xì)胞增殖的情況；應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)復(fù)合材料浸提液中MG63細(xì)胞特征性蛋白堿性磷酸酶和Ⅰ型膠原的表達(dá)情況。結(jié)果 流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4種浸提液中培養(yǎng)的MG63細(xì)胞，48 h后，均有穩(wěn)定的增殖。10%HA/SPEEK/PEEK組增殖指數(shù)為59.3%，高于其他4組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)時(shí)定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4種材料的浸提液培養(yǎng)MG63細(xì)胞于14、21、28 d時(shí)成骨細(xì)胞特征性的蛋白ALP、COLI的DNA的量表達(dá)明顯。10%nHA/SPEEK/PEEK組表達(dá)高于其他4組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各組的表達(dá)均有所下降。結(jié)論 納米PEEK/HA復(fù)合材料對(duì)MG63細(xì)胞有良好的生物相容性。

PEEK/HA復(fù)合材料； MG63成骨細(xì)胞； 細(xì)胞增殖

當(dāng)今社會(huì)，由于腫瘤術(shù)后及外傷等造成骨缺損的患者越來(lái)越多，尤其是頜面部骨缺損，嚴(yán)重影響美觀和功能，因此，人們對(duì)生物醫(yī)用骨替代材料的需求日益增加。在臨床上常用的骨替代材料是金屬，金屬可以提供良好的機(jī)械強(qiáng)度、優(yōu)異的摩擦性和無(wú)毒特性[1]。然而，因其存在一些顯著缺點(diǎn)，阻礙了其更廣泛的醫(yī)療應(yīng)用[2]。羥基磷灰石(hydroxyapatite, HA)具有極好的生物相容性和生物活性，但其機(jī)械強(qiáng)度比人類(lèi)骨皮質(zhì)差。聚醚醚酮(polyether ether ketone, PEEK)具有穩(wěn)定的化學(xué)和物理性質(zhì)[3]。然而，PEEK具有的生物惰性[4]使其應(yīng)用潛力受到限制。因此，將HA與PEEK相混合，研制出性能優(yōu)越的生物材料，是目前各國(guó)學(xué)者亟待解決的問(wèn)題。自2014-2015年，我們采用實(shí)驗(yàn)室制備的PEEK/HA復(fù)合材料與MG63細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)材料對(duì)MG63細(xì)胞特征性蛋白可能造成的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 PEEK/HA生物復(fù)合材料(深圳大學(xué)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室)；RPMI-1640(美國(guó)GIBCO公司)；胎牛血清(美國(guó)HYCLONE公司)；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(碧云天)；Super M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(北京BIOTEKE公司)；RNAsimple Total RNA Kit(北京天根生化有限公司)；RNase固相清除劑(天恩澤)；Powder瓊脂糖(西班牙SPAIN公司)；2×PowerTaqPCRMasterMix(北京BIOTEKE公司)；SYBR Green(北京SOLARBIO公司)。超純水系統(tǒng)(上海HEALFORC公司)；超速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀公司)；CO2培養(yǎng)箱(上海力申公司)；倒置相差顯微鏡(麥克奧迪);電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特公司);流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司);微量移液器(芬蘭IOHIT公司)；紫外分光光度計(jì)(美國(guó)THERMO公司)。

1.2 流式細(xì)胞儀測(cè)定MG63細(xì)胞增殖指數(shù) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG63細(xì)胞制備成8 mg/ml的細(xì)胞懸液，去掉廢液，加入1 ml的PBS清洗細(xì)胞1次后去掉，各組分別加入4種材料培養(yǎng)基PEEK、SPEEK/PEEK、10%HA/SPEEK/PEEK和HA各2 ml。空白組加正常培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)48 h后進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。2000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次，2000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，小心吸除上清。加入預(yù)冷70%乙醇，4℃固定2 h。將固定后的細(xì)胞2000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，棄去上清液，PBS清洗2次，2000 r/min離心5 min，棄上清液，每管細(xì)胞樣品中加入500 μl染色緩沖液，緩慢并充分重懸。加入25 μl碘化丙啶染色液混勻后，加入10 μl RNase A，混勻。37℃避光溫育30 min。冰浴避光存放，隨即進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.3 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)MG63細(xì)胞特征性蛋白的表達(dá) 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的MG63細(xì)胞中，分別加入4種材料培養(yǎng)基PEEK、SPEEK/PEEK、10%HA/SPEEK/PEEK和HA各2 ml，空白組加正常培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)14、21、28 d進(jìn)行相關(guān)基因?qū)Φ臋z測(cè)。采用Real-time PCR法檢測(cè)MG63細(xì)胞內(nèi)ALP和Ⅰ型膠原的基因表達(dá)情況?？俁NA提取試劑盒(天根)提取樣本總RNA，將得到的RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用TIANScript RT Kit(TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒)，對(duì)上步實(shí)驗(yàn)所得的RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以得到對(duì)應(yīng)的cDNA。電泳分析(引物序列見(jiàn)表1)。 本實(shí)驗(yàn)采用韓國(guó)BIONEER公司生產(chǎn)的ExicyclerTM 96熒光定量?jī)x進(jìn)行熒光定量分析。根據(jù)PCR摸索的條件并結(jié)合實(shí)驗(yàn)儀器，最終優(yōu)化得到的熒光定量反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下。反應(yīng)體系：cDNA模板1 μl,上下游引物(10 μM)各0.5 μl,SYBR GREEN mastermix 10 μl,用ddH2O補(bǔ)足至20 μl；反應(yīng)條件：95℃10 min；95℃10 s,60℃20 s,72℃30 s,4℃ 5 min,循環(huán)40次。首先將引物稀釋至10 μM或根據(jù)引物不同情況稀釋。

表1 引物序列表

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用單因素方差加配對(duì)t檢驗(yàn)法，分析MG63細(xì)胞增殖指數(shù)和MG63特征性蛋白的表達(dá)情況。所有的檢測(cè)數(shù)據(jù)至少重復(fù)3次，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果 流式細(xì)胞儀檢測(cè)后，4種材料的浸提液培養(yǎng)MG63細(xì)胞48 h后,細(xì)胞周期結(jié)果見(jiàn)圖1。MG63細(xì)胞維持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，增殖迅速，很少發(fā)生凋亡。其中10%HA/SPEEK/PEEK組的PrI為59.3%，顯著高于其他組。SPEEK組高于PEEK組，高于空白組，低于HA組，差異不顯著。PEEK組低于空白組，低于HA組，差異不顯著。PrI為細(xì)胞增殖指數(shù)，PrI=(S+G2M)/(G01+S+G2M)。與空白組比較，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 Real-time RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 4種材料的浸提液中，MG63細(xì)胞分泌ALP和Ⅰ型膠原的real-time RT-PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2，3。P<0.05，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ALP：10%HA/SPEEK/PEEK組分泌的ALP高于其他組，與PEEK組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在14 d時(shí)與其他3組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在21、28 d時(shí)均略高于HA組，與其他兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；SPEEK/PEEK組在14、21、28 d均明顯高于PEEK組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。略高于空白組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在14 d時(shí)略低于HA組，在21、28 d時(shí)顯著低于HA組。PEEK組顯著低于空白組、HA 組。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各組分泌的ALP有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ⅰ型膠原：10%HA/SPEEK組分泌的Ⅰ型膠原高于其他4組，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SPEEK/PEEK高于PEEK組，14 d時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，21、28 d時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高于空白組低于HA組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PEEK組低于空白組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低于HA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各組分泌的COLI有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

PEEK的機(jī)械性質(zhì)接近人體皮質(zhì)骨[5]。例如，PEEK的彈性模量大約8.3 GPa，人體皮質(zhì)骨的彈性模量為17.7 GPa。比Ti合金(116 GPa)和Co-Cr合金(210 GPa)低得多(J Black, 1998年) 。然而，PEEK并沒(méi)有明顯的促進(jìn)成骨的能力[6]，但具有一定的生物惰性，這一缺點(diǎn)限制了其的應(yīng)用潛力。因此，如何提高PEEK的生物活性，使其能夠充分實(shí)現(xiàn)潛在的顯著效益，是一個(gè)必須解決的難題。目前，有兩種主要方法已被用于改善PEEK的生物活性，包括表面改性和復(fù)合物的制備。表面改性大部分采用物理方法，化學(xué)處理是罕見(jiàn)的。只有濕化學(xué)處理或磺化處理可以用化學(xué)的辦法對(duì)PEEK進(jìn)行改性。因此，本文中提到的磺化PEEK具有材料的先進(jìn)性。

本研究中的另一種材料納米PEEK/HA復(fù)合物，是應(yīng)用第二種方法來(lái)改善PEEK性能的，效果顯著。納米晶材料的典型特征是一微觀結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度或粒徑從幾納米到約100 nm。納米晶體的HA顆粒具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，與其微米尺寸對(duì)比[7]，顯示出較高的機(jī)械強(qiáng)度和優(yōu)異的生物相容性。HA納米顆粒結(jié)合到聚合物基體，可以接近模擬天然骨的結(jié)構(gòu)。人骨是一種HA納米晶體和膠原纖維組成的生物復(fù)合材料。合成的納米HA已被發(fā)現(xiàn)，可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附和有效地增殖[8]。目前，可以使用多種技術(shù)來(lái)獲得不同尺寸和形狀的納米HA，如化學(xué)共沉淀法、水熱路線(xiàn)、膠束模板來(lái)合成溶膠-凝膠等[9-11]。因此，可以將納米HA與PEEK相復(fù)合，以獲得矯形承重的潛力材料。 PEEK的生物惰性通常會(huì)產(chǎn)生不理想的骨植入物的整合[12]，但其生物活性和生物相容性，通過(guò)增加納米級(jí)別的HA可大大增強(qiáng)。有研究證明[13]，將納米級(jí)別的HA添加到PEEK中，可以刺激成骨細(xì)胞活性，從而誘導(dǎo)更多的骨生長(zhǎng)。通過(guò)模仿人體骨骼的結(jié)構(gòu)和特性，進(jìn)而研制納米HA/PEEK復(fù)合材料。對(duì)其生物相容性進(jìn)行探討是現(xiàn)階段研究的主要內(nèi)容。

圖1 流式細(xì)胞儀測(cè)試5組MG63細(xì)胞的增殖情況 圖2 4組材料中MG63細(xì)胞ALP表達(dá)情況 圖3 4組材料中MG63細(xì)胞Collagen Ⅰ表達(dá)情況
Fig 1 Proliferation of MG63 cell in 5 groups detected by flow cytometry. Fig 2 Expression of ALP of MG63 cells in 4 groups. Fig 3 Expression of collagen Ⅰ of MG63 cells in 4 groups.

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，可以得出以下結(jié)論：4種PEEK復(fù)合材料浸提液中，MG63細(xì)胞均生長(zhǎng)增殖良好。其中10%HA/SPPEK/PEEK浸提液組的MG63細(xì)胞的特征性蛋白表達(dá)最顯著；其次是HA組；第三是SPPEK/PEEK組；最低是PEEK組。但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，特征性蛋白的表達(dá)均有所下降。為今后將納米HA/PEEK復(fù)合材料早日應(yīng)用于臨床，起到了指導(dǎo)作用。

[1] Ribeiro DA, Matsumoto MA, Padovan LE, et al. Genotoxicity of corrosion eluates obtained from endosseous implants[J]. Implant Dent, 2007,16(1):101-109.

[2] Thomas P, Maier S, Summer B. Allergie reactions to metal implants[J]. Materialwissenschaft Werkstofftechnik, 2004,35(12):997-1000.

[3] Kurtz SM, Devine JN. PEEK biomaterials in trauma, orthopedic, and spinal implants[J]. Biomaterials, 2007,28(32):4845-4869.

[4] Briem D, Strametz S, Schr?der K, et al. Response of primary fibroblasts and osteoblasts to plasma treated polyetheretherketone (PEEK) surfaces[J]. J Mater Sci Mater, Med, 2005,16(7):671-677.

[5] Wang H, Xu M, Zhang W, et al. Mechanical and biological characteristics of diamond-like carbon coated poly aryl-ether-ether-ketone[J]. Biomaterials, 2010,31(32):8181-8187.

[6] Briem D, Strametz S, Schr?der K, et al. Response of primary fibroblasts and osteoblasts to plasma treatedpolyetheretherketone (PEEK) surfaces[J]. J Mater Sci Mater Med, 2005,16(7):671-677.

[7] Zhang LJ, Webster TJ. Nanotechnology and nanomaterials: Promises forimproved tissue regeneration[J]. Nano Today, 2009,4:66.

[8] Webster TJ, Ergun C, Doremus RH, et al. Enhanced functions of osteoblasts on nanophase ceramics[J]. Biomaterials, 2000,21(17):1803-1810.

[9] Von der Mark K, Park J, Bauer S, et al. Nanoscale engineering of biomimetic surfaces: cues from the extracellular matrix[J]. Cell Tissue Res, 2010,339(1):131-153.

[10] Motskin M, Wright DM, Muller K, et al. Hydroxyapatite nano and microparticles: correlation of particle properties with cytotoxicity and biostability[J]. Biomaterials, 2009,30(19):3307-3317.

[11] Park J, Nam S, Kim H, et al. Pressing effect in polymer solar cells with bulk heterojunction nanolayers[J]. J Nanosci Nanotechnol, 2011,11(1):318-321.

[12] Sagomonyants KB, Jarman-Smith ML, Devine JN, et al. The in vitro response of human osteoblasts to polyetheretherketone (PEEK) substrates compared to commercially pure titanium[J]. Biomaterials, 2008,29(11):1563-1572.

[13] Guo X, Gough JE, Xiao P, et al. Fabrication of nanostructured hydroxyapatite and analysis of human osteoblastic cellular response[J]. J Biomed Mater Res A, 2007,82(4):1022-1032.

Effects of PEEK/HA on proliferation and differentiation of MG63 cells

RENYing-hua,AIHong-jun,LIUXue,NIZhuo,WANGYang,ZHANGLi-qun.

(DepartmentofStomatology,ShenzhenNanshanPeople′sHospital,Shenzhen518052,China)

AIHong-jun,Email:13940066221@163.com;LIUXue,Email:xliu663@aliyun.com

Objective To study the effect of PEEK/HA composite materials on MG63 cell compatibility. Methods Flow cytometry(FCM) was used to study proliferation of MG63 in different components of the composite material leaching liquors. Real-time quantitative RT-PCR was adopted to detect the expression of proteins characteristic of alkaline phosphatase and type I collagen of MG63 cells in different components of the composite material leaching liquors. Results Flow cytometry results showed that MG63 cells cultured in the 4 leaching liquors at 48 hours had stable growth. The proliferative index in the 10% HA/SPEEK/PEEK group was 58.7% which was higher than that in the other three groups and the control group. The difference was statistically significant. Real-time quantitative RT-PCR results showed in MG63 cells cultured by 4 leaching liquors at 14 days, 21 days, 28 days, the expression of the characteristic protein ALP, and COLI of osteoblasts was obvious, especially in the 10% nHA/SPEEK/PEEK group which was higher than that in the other three groups and control group, the difference was significant. As time passed, the expression in each group has declined. Conclusion PEEK/HA composite materials have good biocompatibility with MG63 cells.

PEEK/HA composite material; MG63 Osteoblasts; Cell proliferation

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(JCYJ20140411094009912)；深圳市南山區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014003)

518052 廣東 深圳，廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳南山醫(yī)院 口腔科(任英華, 劉 學(xué), 王 楊, 章立群);中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 修復(fù)科(艾紅軍)；深圳大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院(倪 卓)

任英華(1978-)，女，遼寧沈陽(yáng)人，主治醫(yī)師，博士研究生.

艾紅軍，110002，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 修復(fù)科，電子信箱：13940066221@163.com;劉 學(xué)，518052，廣東醫(yī)學(xué)院附屬深圳南山醫(yī)院 口腔科，電子信箱：xliu663@aliyun.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.04.020

R318.08

A

1673-7040(2016)04-0252-04

2015-11-20)