董亞琴，黃倩茹，萬　　隆，許金森（福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003）

心肌缺血損傷大鼠心肌P2X3受體mRNA表達的變化

董亞琴，黃倩茹，萬隆，許金森
（福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003）

目的觀察異丙腎上腺素（ISO）誘發(fā)大鼠心肌缺血損傷時，模型大鼠心肌P2X3受體mRNA表達的變化。方法成年雄性SD大鼠16只，隨機分為心肌缺血損傷組和對照組，每組8只，采用Q-PCR法觀察心肌缺血損傷組心肌P2X3受體mRNA表達的變化。結(jié)果心肌缺血損傷組大鼠心肌P2X3受體mRNA表達較對照組明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論心肌缺血損傷模型大鼠心肌P2X3受體表達增加，說明P2X3受體在心肌缺血損傷時敏感性明顯增強，參與了心肌缺血損傷的病理變化過程。

心肌缺血；P2X3受體；異丙腎上腺素

異丙腎上腺素會導(dǎo)致大鼠急性心肌缺血損傷，這種損傷與人體急性心肌缺血相似［1-2］。心肌缺血損傷時大量釋放的三磷酸腺苷（ATP）可引起心絞痛等疼痛癥狀［3］。P2X3受體是ATP的主要受體，在疼痛的傳遞和處理中起重要作用［4］。P2X3受體在大劑量ATP導(dǎo)致的心功能異常中的作用尚不清楚，本實驗通過觀察大鼠心肌缺血損傷時，心肌P2X3受體mRNA的表達變化，了解P2X3受體在心功能異常時的作用。

1材料與方法

1.1實驗動物雄性SD大鼠，體質(zhì)量220～250 g，福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（閩）2012-0001。

1.2主要試劑及儀器

1.2.1主要試劑異丙腎上腺素（ISO）（美國Sigma公司）；Sybr premix ExTaq TM（日本TakaRa公司）；Trizol Reagent（美國invitrogen公司）；PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TakaRa公司）；引物由日本TakaRa公司合成。

1.2.2主要儀器7500 Fast Real-Time PCR System（美國 Applied Biosystems公司）；梯度熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；Allegra 64R型臺式高速冷凍離心機（美國Beckman公司）；微量加樣槍（德國Eppendorf公司）；NanoDrop 2000分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3心肌缺血損傷大鼠模型的制作雄性SD大鼠16只，隨機分為心肌缺血損傷組和對照組，每組8只。心肌缺血損傷模型的制作方法：按每日60mg/kg的劑量（40 mg/mL溶于生理鹽水中）于背部皮下多部位注射異丙腎上腺素，連續(xù)注射2 d，間隔24 h。對照組于背部皮下多部位注射與模型組等量的生理鹽水，連續(xù)注射2 d，間隔24 h。心肌缺血損傷大鼠模型制模成功的心電圖出現(xiàn)S-T段下移，異常Q波。

1.4RNA的提取和質(zhì)量檢測制模成功次日，大鼠腹腔注射10%的水合氯醛，麻醉后斷頸處死，立即取出心臟組織，用PBS沖洗，迅速放入RNA保存液，-4℃冰箱保存。取新鮮凍存心臟組織，將左心室剪成所需大小組織，用Trizol一步法提取細胞中的總RNA，NanoDrop 2000分光光度計檢測RNA純度和濃度。1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射光下觀察，檢測RNA的完整性。

1.5實時熒光定量PCR每個樣本分別取2 μg 總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，所得cDNA于-80℃保存。引物序列見表1。

熒光定量 PCR反應(yīng)體系：Sybr premix ExTaq TM 10 μL，primer-F：0.4 μL，primer-R：0.4 μL，ROX II：0.4 μL，ddH2O 6.8 μL，cDNA 2 μL，20 μL體系。反應(yīng)條件：① 預(yù)變性 95℃30 s；② 變性：95℃5 s；③ 退火，延伸，60℃30 s，40個循環(huán)。采用ABI 7500 Real time PCR儀檢測各樣本中mRNA的表達情況。實驗采用ΔΔCt法：每個標本重復(fù)3次，Ct值取平均值；以GAPDH作為內(nèi)參照，ΔCt值＝P2X3基因Ct值－GAPDH基因Ct值；以生理鹽水組為對照，ΔΔCt值＝心肌缺血損傷組心肌P2X3的ΔCt值－生理鹽水對照組心肌P2X3的ΔCt值。以生理鹽水對照組心肌P2X3的基因表達量為 1，2-ΔΔCt值即為心肌缺血損傷組心肌P2X3基因表達的倍數(shù)，測定值以2-ΔΔCt≥2作為高表達的標準。

2結(jié)果

實驗結(jié)果見表2。

表2　2組大鼠心肌P2X3受體mRNA的表達

3討論

注射ISO制備心肌缺血損傷模型是常見的研究模型之一，大鼠注射ISO后心肌組織缺血壞死導(dǎo)致心肌細胞膜破壞，釋放ATP。ATP不僅是細胞內(nèi)的能量物質(zhì)，而且可以作用于細胞表面的嘌呤受體產(chǎn)生信號傳導(dǎo)作用。P2X3受體是ATP的主要受體，在傷害性信息（疼痛）的傳遞和處理中起重要作用。本實驗結(jié)果顯示，與生理鹽水對照組比較，心肌缺血大鼠心肌P2X3受體mRNA表達明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義。心肌缺血大鼠心肌P2X3受體表達的增加，表明P2X3受體在心肌缺血損傷時敏感性明顯增強，參與了心肌缺血損傷的病理變化過程。ATP作用于P2X3受體引發(fā)痛覺及傷害性信息傳遞，從而導(dǎo)致心肌缺血引起心絞痛等傷害性反應(yīng)。

［1］高海成，孫波，苗春生，等.大劑量鹽酸異丙腎上腺素誘發(fā)大鼠心肌缺血性壞死模型的建立 ［J］.中國生物制品學(xué)雜志，2009，22（3）：288-290.

［2］張云，王階，郭麗麗.異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌缺血損傷模型的研究進展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2010，16（23）：3527-3531.

［3］嚴琴，張英，劉雨生，等.電針內(nèi)關(guān)穴對心肌痛大鼠心肌和下丘腦P2X3受體影響的研究［J］.湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，16（5）：5-8.

［4］GINIATULIN R，NISTRI A.Desensitization properties of P2X3 receptors shaping pain signaling［J］.Frontiers in Cellular Neuroscience，2013，7：245.

R-332

B

1000-338X（2016）03-0022-02

2016-03-02

國家自然科學(xué)基金青年項目資助課題（81403490），福建省科技廳省屬公益類項目（2014R1035-6），福建省教育廳中青年教師教育科研B類項目資助課題（JB14050）

董亞琴（1979—），女，助理研究員，碩士，主要從事中醫(yī)經(jīng)絡(luò)現(xiàn)代研究。

許金森（1963—），男，研究員。E-mail：xujinsenjls@163.com