陳　　翔，段曉敏，林　　煜，黃云梅，黃美雅，賈曉康，林燕萍（.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350；.福州市第二醫(yī)院，福建 福州 350007）

·實(shí)驗(yàn)研究·

鹿銜草對(duì)去卵巢大鼠骨形成的促進(jìn)作用

陳翔1，段曉敏1，林煜2，黃云梅1，黃美雅1，賈曉康1，林燕萍1
（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122；2.福州市第二醫(yī)院，福建 福州 350007）

目的觀察鹿銜草對(duì)去卵巢大鼠骨形成的作用。方法將3月齡SD雌性大鼠通過(guò)手術(shù)切除雙側(cè)卵巢，隨機(jī)分為鹿銜草高、中、低劑量組、生理鹽水組、骨疏康對(duì)照組，另設(shè)假手術(shù)組，分別進(jìn)行干預(yù)，術(shù)后4、8、12周分批處死，行骨密度、股骨干骺端骨小梁面積、雌二醇、骨鈣素水平檢測(cè)，Bradford法檢測(cè)骨組織中骨堿性磷酸酶蛋白含量。結(jié)果各用藥組可增加骨密度、骨小梁面積百分比，提高血清中雌二醇、骨鈣素水平，增加骨堿性磷酸酶的表達(dá)。結(jié)論鹿銜草對(duì)去卵巢大鼠的骨形成有促進(jìn)作用。

鹿銜草；絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥；大鼠模型；骨堿性磷酸酶；骨鈣素

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是中老年婦女常見的一種代謝性疾病。中醫(yī)認(rèn)為PMOP屬“骨痿”、“骨痹”范疇，病因主要為“腎虛”。因此，針對(duì)PMOP中醫(yī)常以補(bǔ)腎立法施治。在骨傷方藥中，鹿銜草作為補(bǔ)腎健骨強(qiáng)筋的藥物被廣泛應(yīng)用，本課題組前期研究［1］結(jié)果顯示：鹿銜草能明顯促進(jìn)體外成骨細(xì)胞的增殖和分化。為進(jìn)一步明確鹿銜草對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的防治機(jī)理，我們通過(guò)在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察鹿銜草對(duì)去卵巢大鼠骨形成的促進(jìn)作用。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)藥物鹿銜草顆粒（培力藥業(yè)有限公司，批號(hào)：A100099-02）；骨疏康顆粒（遼寧康辰藥業(yè)有限公司，批號(hào)：101109）。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模、分組選3月齡健康清潔級(jí)雌性SD大鼠180只［上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2010-0002，編號(hào)：0021099］，體質(zhì)量（200±20）g。將大鼠隨機(jī)分為卵巢切除組150只、假手術(shù)組30只。卵巢切除組用2%戊巴比妥鈉麻醉，取腹部正中切口，結(jié)扎切除卵巢，術(shù)后肌注青霉素預(yù)防感染。假手術(shù)組除不結(jié)扎摘除雙側(cè)卵巢外，其它同卵巢切除組。術(shù)后將卵巢切除組150只大鼠隨機(jī)分為鹿銜草高、中、低劑量組、骨疏康顆粒組、生理鹽水組，每組30只。

1.3藥物干預(yù)大鼠于手術(shù)后第3天開始干預(yù)，鹿銜草低、中、高劑量組分別給鹿銜草顆粒0.125 g/ （kg/d）、0.25 g/（kg/d）、0.50 g/（kg/d），骨疏康組給骨疏康顆粒1.5 g/（kg/d），所有顆粒藥物以2 mL生理鹽水溶解灌服，生理鹽水組、假手術(shù)組大鼠每只每日灌服生理鹽水2 mL/只，每日1次。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在室溫（23±2）℃、濕度70%條件下喂養(yǎng)，自由攝食、飲水、活動(dòng)。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材卵巢切除組、假手術(shù)組于術(shù)后4周、8周、12周3個(gè)批次取材，用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，檢測(cè)大鼠全身骨密度。腹主動(dòng)脈取血，離心取血清保存待測(cè)；取第3腰椎和右側(cè)股骨保存待測(cè)。

1.5標(biāo)本檢測(cè)用Expert雙能X線骨密度儀（美國(guó)Lunar公司）檢測(cè)大鼠全身骨密度。用ELisa法檢測(cè)血清中雌二醇（E2）、骨鈣素（BGP），試劑盒來(lái)自美國(guó)R&D公司。制備骨勻漿，Bradford法檢測(cè)骨堿性磷酸酶（BALP）含量。HE染色制備骨組織病理切片，用全自動(dòng)真彩色圖像分析總組織面積（T.Ar）、骨小梁面積 （Tb.Ar），計(jì)算骨小梁面積百分率（Tb. Ar%）并進(jìn)行圖像觀察。

2結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1～表5。

3討論

3.1本研究使用的去勢(shì)雌性大鼠動(dòng)物模型，因其在短期內(nèi)顯著降低雌激素水平，很好的模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥骨代謝的特點(diǎn)，被廣泛用于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥研究［2］。BGP和BALP作為反映骨形成的特異性指標(biāo)，已廣泛用于實(shí)驗(yàn)研究。其中BGP是由成熟的成骨細(xì)胞合成分泌，其功能主要與骨轉(zhuǎn)換有關(guān)。目前認(rèn)為，當(dāng)骨形成與骨吸收偶聯(lián)時(shí)，BGP可反映骨轉(zhuǎn)換情況。當(dāng)骨形成與骨吸收解偶聯(lián)時(shí)，BGP可特異性地反映骨形成情況［3］。在評(píng)價(jià)藥物治療骨質(zhì)疏松癥的療效上，BGP水平上升，提示藥物刺激了骨的形成，BGP水平下降提示藥物減緩了骨的吸收［4］。研究［5-8］顯示BGP的表達(dá)在骨質(zhì)疏松模型中有明顯升高。另外，BALP是堿性磷酸酶（ALP）同工

表1　6組大鼠股骨的骨密度檢測(cè)結(jié)果（±s）gms/cm2

表1　6組大鼠股骨的骨密度檢測(cè)結(jié)果（±s）gms/cm2

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.05；與生理鹽水組比較，2）P＜0.05。

組別假手術(shù)組生理鹽水組骨疏康組鹿銜草高劑量組鹿銜草中劑量組鹿銜草低劑量組大鼠/只8 9 8 9 9 9手術(shù)后4周0.147±0.005 0.148±0.005 0.147±0.007 0.147±0.007 0.149±0.007 0.144±0.005手術(shù)后8周0.164±0.011 0.150±0.0031）0.160±0.0072）0.160±0.0052）0.159±0.0082）0.159±0.0052）手術(shù)后12周0.166±0.007 0.156±0.0051）0.163±0.0052）0.163±0.0072）0.163±0.0072）0.164±0.0112）

表2　6組大鼠血清E2水平（±s）ng/L

表2　6組大鼠血清E2水平（±s）ng/L

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.05；與生理鹽水組比較，2）P＜0.05。

組別假手術(shù)組生理鹽水組骨疏康組鹿銜草高劑量組鹿銜草中劑量組鹿銜草低劑量組大鼠/只8 9 8 9 9 9手術(shù)后4周64.26±5.00 39.66±5.351）52.95±6.881）2）52.54±6.031）2）52.89±8.181）2）52.49±9.871）2）手術(shù)后8周81.78±3.80 50.10±5.741）71.01±5.691）2）69.26±6.101）2）69.30±7.161）2）69.24±5.231）2）手術(shù)后12周80.26±4.39 47.38±6.181）70.38±8.101）2）65.78±5.801）2）66.09±8.781）2）68.73±10.581）2）

表3　6組大鼠血清BGP檢測(cè)結(jié)果（±s）ng/L

表3　6組大鼠血清BGP檢測(cè)結(jié)果（±s）ng/L

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.05。

組別假手術(shù)組生理鹽水組骨疏康組鹿銜草高劑量組鹿銜草中劑量組鹿銜草低劑量組大鼠/只8 9 8 9 9 9手術(shù)后4周483.00±25.84 572.63±75.021）570.58±36.471）585.81±54.652）619.44±69.992）558.22±76.831）手術(shù)后8周784.04±15.27 867.53±59.03 832.10±97.30 812.12±37.55 810.37±69.41 831.62±66.84手術(shù)后12周695.20±30.71 834.22±102.852）820.96±58.741）844.82±51.762）776.41±77.42 778.17±88.02

表4　6組大鼠骨小梁面積百分比變化（±s）

表4　6組大鼠骨小梁面積百分比變化（±s）

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與生理鹽水組比較，3）P＜0.01，4）P＜0.05。

組別假手術(shù)組生理鹽水組骨疏康組鹿銜草高劑量組鹿銜草中劑量組鹿銜草低劑量組大鼠/只8 9 8 9 9 9手術(shù)后4周0.5746±0.029 0.4687±0.0812）0.5281±0.081 0.5194±0.035 0.5383±0.0383）0.5086±0.0332）手術(shù)后8周0.6052±0.023 0.4378±0.0402）0.5010±0.0612）3）0.5154±0.0672）3）0.5078±0.0562）4）0.5298±0.0412）3）手術(shù)后12周0.5510±0.023 0.4208±0.0532）0.4790±0.0611）4）0.4843±0.0631）4）0.5089±0.0991）3）0.4793±0.0432）4）

表5　6組大鼠BALP檢測(cè)結(jié)果（±s）U/gprot

表5　6組大鼠BALP檢測(cè)結(jié)果（±s）U/gprot

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.05；與生理鹽水組比較，2）P＜0.05。

組別假手術(shù)組生理鹽水組骨疏康組鹿銜草高劑量組鹿銜草中劑量組鹿銜草低劑量組大鼠/只8 9 8 9 9 9手術(shù)后4周229.14±23.61 240.57±35.18 207.18±15.77 204.16±42.54 204.66±26.56 205.79±38.38手術(shù)后8周187.78±20.74 237.84±29.711）259.45±49.201）250.96±48.031）260.22±53.541）251.84±55.111）手術(shù)后12周199.35±34.85 238.03±33.641）234.52±34.111）272.29±45.721）2）270.05±33.321）2）263.07±18.971）

酶之一，由成骨細(xì)胞分泌，能促進(jìn)骨的形成。研究表明［9-12］BALP在骨質(zhì)疏松發(fā)病活動(dòng)期有顯著增高，是成骨細(xì)胞活性增加的重要標(biāo)志，其定量測(cè)定和動(dòng)態(tài)觀察可為骨質(zhì)疏松癥的早期診斷和療效判定提供有效依據(jù)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)BALP和BGP在去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型中呈顯著表達(dá)，與骨質(zhì)疏松發(fā)生程度呈正相關(guān)［13］。

3.2研究顯示，雌性大鼠在切除雙側(cè)卵巢后，與假手術(shù)組比較，生理鹽水組的E2顯著降低，而同期血清BGP水平及BALP活性明顯升高，可能由于卵巢摘除后引起大鼠體內(nèi)雌性激素減少，對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用減弱，破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，骨吸收亢進(jìn)，進(jìn)而出現(xiàn)代償性的骨形成增強(qiáng)［14］。由于骨吸收大于骨形成，引起骨小梁含量降低，導(dǎo)致生理鹽水組骨小梁面積百分比和BMD的下降。各用藥組的E2水平低于同期的假手術(shù)組，高于同期的生理鹽水組。表明鹿銜草高中低劑量組能有效的提升機(jī)體E2水平。除12周鹿銜草高劑量組外，8周、12周各用藥組血清BGP濃度均高于同期假手術(shù)組，低于同期生理鹽水組。8周、12周BALP活性高于同期假手術(shù)組，推測(cè)鹿銜草中、低劑量組可以降低骨轉(zhuǎn)化，促進(jìn)骨形成。鹿銜草高劑量組能更有效提高成骨細(xì)胞活性，刺激骨形成。因此，鹿銜草高、中、低各劑量組的骨形成速率大于骨吸收，使得骨小梁面積百分比和BMD的提高。

3.3研究表明鹿銜草治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥有良好的療效，其機(jī)理是通過(guò)促進(jìn)骨形成，改善骨代謝。

［1］吳銀生，黃美雅，陳旭征.鹿銜草不同極性部位對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響［J］.中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志，2010，18（9）：4-6.

［2］周麗，鄧偉民.去勢(shì)雌性大鼠動(dòng)物模型在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中的應(yīng)用 ［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12（7）：1323-1326.

［3］黃江渝，胡汶竹.血清骨鈣素水平檢測(cè)的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，34（9）：1674-1675.

［4］冼華，曹文富.血中骨代謝生化指標(biāo)在骨質(zhì)疏松癥診治中的意義［J］.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2007，13（1）：69-73.

［5］賈玉巧，王宇梅，高艷榮，等.大鼠骨質(zhì)疏松模型中骨堿性磷酸酶和白細(xì)胞介素-6及腫瘤壞死因子-α的表達(dá)［J］.中國(guó)婦幼保健，2007，22（36）：5188-5190.

［6］岳建明，周耀柱，周茹等.氟伐他汀對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠血清 E2、TNF-α、IGF-1及BGP水平的影響［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2013（28）：3366-3367.

［7］于學(xué)美，崔西泉，董軍，等.益氣補(bǔ)腎活血方對(duì)失用性骨質(zhì)疏松模型大鼠BMD、BGP、BAP的影響［J］.世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，9（5）：480-482.

［8］李旭斌，王桂敏.二仙湯對(duì)去勢(shì)后大鼠骨質(zhì)疏松的影響研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2014，39（15）：2960-2963.

［9］陳冠儒，陳飛虎，葛金芳，等.葛根總黃酮對(duì)去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松的保護(hù)作用［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，49（6）：759-763.

［10］程敏，王慶偉，劉雪英，等.女貞子治療去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2013，29（2）：229-233.

［11］劉瑤，劉永波，莫燁華，等.仙鹿顆粒對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的防治作用研究［J］.中藥材，2014，37（12）：2275-2278.

［12］劉冬梅，袁林，蘇林沖，等.強(qiáng)骨康疏膠囊對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松癥模型大鼠細(xì)胞因子的影響 ［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2014，30 （3）：338-341.

［13］薛蔭昌，賈玉巧，許秀輝，等.大鼠骨質(zhì)疏松模型中骨堿性磷酸酶、白細(xì)胞介素-6及骨鈣素的表達(dá)［J］.職業(yè)與健康，2010，26（6）：608-610.

［14］王曉，梅其炳，劉莉，等.骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的復(fù)制與評(píng)價(jià)［J］.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2007，13（2）：141-145.

R285.5

B

1000-338X（2016）03-0012-02

2016-03-29

國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題（81574003），福建省科技廳引導(dǎo)性項(xiàng)目（2015Y0069）

陳翔（1991—），男，2014級(jí)中醫(yī)骨傷專業(yè)碩士研究生，主要從事骨傷基礎(chǔ)研究。

林燕萍（1963—），女，教授。E-mail：lyp66@126.com