郭　塹, 農(nóng)村立

(廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院 感染科, 廣西 柳州, 545005)

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TGF-β1PDGF-BB及CTGF在慢性乙型肝炎患者肝組織中的表達(dá)及意義

郭塹, 農(nóng)村立

(廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院 感染科, 廣西 柳州, 545005)

摘要:目的探討慢性乙型肝炎(CHB)患者肝纖維化不同階段轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、血小板源性生長(zhǎng)因子-BB(PDGF-BB)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)在肝組織中的表達(dá)及意義。方法根據(jù)慢性肝炎分期標(biāo)準(zhǔn)，將80例CHB患者分為S0組、S1組、S2組、S3組和S4組，觀察各組肝組織TGF-β1、PDGF-BB、CTGF免疫組織化學(xué)染色；比較各組肝組織TGF-β1、PDGF-BB、CTGF含量，以及血清Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)水平，并分析TGF-β1、PDGF-BB、CTGF水平與血清肝纖維化相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果TGF-β1、PDGF-BB、CTGF免疫組化染色結(jié)果及水平比較表明，肝組織中TGF-β1、PDGF-BB、CTGF水平均與肝纖維化程度密切相關(guān)，且隨肝纖維化程度的加重而增加。從S0組到S4組，血清PCⅢ、CⅣ、HA、LN水平依次遞增，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。相關(guān)性分析結(jié)果表明，肝組織中TGF-β1、PDGF-BB、CTGF水平均與血清PCⅢ、CⅣ、HA、LN水平呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論在肝纖維化的不同階段，肝組織中TGF-β1、PDGF-BB、CTGF表達(dá)水平隨肝纖維化程度的加重而增加，在早期肝纖維化診斷方面具有重要價(jià)值。

關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1; 血小板源性生長(zhǎng)因子; 結(jié)締組織生長(zhǎng)因子; 慢性乙型肝炎

肝纖維化是慢性乙型肝炎(CHB)發(fā)展為肝硬化的重要病理變化，主要表現(xiàn)為肝臟纖維結(jié)締組織增生、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積等。目前普遍認(rèn)為，肝纖維化的發(fā)生與肝星狀細(xì)胞(HSC)激活過程密切相關(guān)[1-2]。HSC激活后，大量ECM被合成，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)活性下降，MMP組織抑制因子合成增加，纖維基質(zhì)降解減少，沉積增加。在肝纖維化啟動(dòng)、發(fā)展、肝硬化形成過程中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)發(fā)揮核心作用，且與HSC、實(shí)質(zhì)細(xì)胞、纖維化相關(guān)生長(zhǎng)因子及各種酶類具有相互作用[3]。血小板源性生長(zhǎng)因子-BB(PDGF-BB)是作用于HSC的最重要促有絲分裂原。多種因素引起的肝損害均可導(dǎo)致肝臟多種細(xì)胞合成并釋放PDGF-BB, 以促進(jìn)HSC轉(zhuǎn)化為肌樣成纖維細(xì)胞，從而加速肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展[4]。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)主要來源于HSC，能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其分泌ECM。研究[5]發(fā)現(xiàn)，機(jī)體CTGF表達(dá)上調(diào)可作為HSC活化的標(biāo)志。本研究通過觀察CHB肝纖維化不同階段TGF-β1、PDGF-BB及CTGF在肝組織的表達(dá)水平，并探討其與肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，以期為臨床評(píng)估肝纖維化提供更多的理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2012年4月—2015年4月廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院收治的CHB患者80例，均行肝臟活體組織穿刺病理檢查，排除標(biāo)準(zhǔn): ① 酒精性肝病、脂肪肝；② 甲、丙、戊型肝炎或重疊感染; ③ 藥物性肝病; ④ 自身免疫性肝病、腫瘤，以及其他器官組織纖維化。其中男42例，女38例；年齡19～50歲，平均(39.5±2.0)歲；病程30 d～15年。參考《病毒性肝炎防治方案》[6]中對(duì)慢性肝炎的分期標(biāo)準(zhǔn)，分為5組，即S0組15例、S1組16例、S2組17例、S3組17例、S4組15例。各組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見表1。

表1　各組一般資料

1.2方法

1.2.1肝臟活體組織穿刺: 行肝臟活體組織穿刺前對(duì)血小板計(jì)數(shù)、凝血酶原時(shí)間、凝血酶原活動(dòng)度等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，以確定患者是否符合肝穿活檢適應(yīng)證。本研究入組80例患者均符合該適應(yīng)證，在SoNoLiNEVerSA plus型彩色多普勒超聲(德國西門子)引導(dǎo)下，用穿刺槍行肝臟組織穿刺術(shù)，取肝組織10×1 mm, 經(jīng)10%福爾馬林固定，送病理檢查，進(jìn)行炎癥分級(jí)和纖維化分期。肝組織常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，行常規(guī)HE染色、Masson染色、網(wǎng)狀纖維染色，水洗、封片后，經(jīng)病理圖像分析系統(tǒng)讀片。

1.2.2肝功能與血清肝纖維化指標(biāo)檢測(cè): 實(shí)驗(yàn)開始前，清晨空腹采集靜脈血3 mL, 離心后取血清，行常規(guī)肝功能和乙型病毒性肝炎(HBV)-DNA檢測(cè)。采用放射免疫分析法檢測(cè)血清肝纖維化指標(biāo)，包括血清Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)。檢測(cè)試劑盒均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.2.3TGF-β1、PDGF-BB、CTGF免疫組織化學(xué)染色: 石蠟切片后，經(jīng)脫蠟、過氧化氫孵育、蒸餾水漂洗、抗原修復(fù)、滴加一抗和二抗、磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗、DAB顯色等步驟，鏡下觀察染色結(jié)果。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，采用美國IPP彩色圖像分析軟件測(cè)定每一視野中TGF-β1、PDGF-BB、CTGF的含量，取10個(gè)視野的平均值為本張切片的陽性染色含量。彩色圖像分析軟件測(cè)定單位為面密度。

1.3觀察指標(biāo)

比較各組肝組織TGF-β1、PDGF-BB、CTGF含量，以及血清PCⅢ、CⅣ、HA、LN水平；分析TGF-β1、PDGF-BB、CTGF與血清肝纖維化相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1各組肝組織TGF-β1、PDGF-BB、CTGF免疫組化染色結(jié)果

肝組織TGF-β1免疫組化染色陽性顯色為棕黃色, S0組未見陽性反應(yīng)物質(zhì)(圖1A); S1、S2組陽性染色主要位于肝竇壁細(xì)胞、肝竇周細(xì)胞，著色較淺(圖1B、1C); S3、S4組可見大量陽性染色物質(zhì)，主要位于纖維間隔、肝細(xì)胞，著色較深(圖1D、1E)。

肝組織PDGF-BB免疫組化陽性染色呈棕黃色, S0組未見陽性染色物質(zhì)(圖2A)；S1、S2組陽性染色物質(zhì)主要分布于肝竇壁細(xì)胞、肝竇周細(xì)胞、肝間質(zhì)細(xì)胞和肝細(xì)胞，染色較明顯(圖2B、2C); S3、S4組陽性染色主要分布于纖維間隔區(qū)域，染色最深(圖2D、2E)。

肝組織CTGF免疫組化染色結(jié)果顯示，陽性染色物質(zhì)為棕黃色，S0組未見明顯CTGF陽性染色物質(zhì)(圖3A)，S1、S2組可見CTGF陽性染色程度較淺，主要分布于纖維化區(qū)(圖3B、3C); S3、S4組可見CTGF陽性染色程度較深，主要分布于纖維化區(qū)、HSC、成纖維細(xì)胞中(圖3D、3E)。

2.2各組肝組織TGF-β1、PDGF-BB、CTGF含量比較

從S0組到S4組，TGF-β1、PDGF-BB、CTGF的面密度逐漸增加，各組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 見表2?？梢?，肝臟TGF-β1、PDGF-BB、CTGF水平與其纖維化程度密切相關(guān)，隨著肝纖維化程度的加重而表達(dá)增多。

注:1A:S0組;1B:S1組;1C:S2組;1D:S3組;1E:S4組圖1 各組肝組織TGF-β1免疫組化染色

注:2A:S0組;2B:S1組;2C:S2組;2D:S3組;2E:S4組圖2 各組肝組織PDGF-BB免疫組化染色

注:3A:S0組;3B:S1組;3C:S2組;3D:S3組;3E:S4組圖3 各組肝組織CTGF免疫組化染色

表2　各組肝組織TGF-β1、PDGF-BB、CTGF含量比較　×10-2, g/m2

與S0組比較，**P<0.01; 與S1組比較, ##P<0.01; 與S2組比較, △△P<0.01; 與S3組比較, ▲▲P<0.01。

2.3各組血清PCⅢ、CⅣ、HA、LN水平比較

從S0組到S4組，血清PCⅢ、CⅣ、HA、LN水平依次遞增，各組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 見表3?？梢? CHB患者血清PCⅢ、CⅣ、HA、LN水平與肝纖維化程度密切相關(guān)，隨著肝纖維化程度的加重而增加。

表3　各組血清PCⅢ、CⅣ、HA、LN水平比較　μg/L

與S0組比較，**P<0.01; 與S1組比較, ##P<0.01; 與S2組比較, △△P<0.01; 與S3組比較, ▲▲P<0.01。

2.4TGF-β1、PDGF-BB、CTGF與血清肝纖維化指標(biāo)的相關(guān)性

肝組織TGF-β1與血清PCⅢ、CⅣ、HA、LN水平呈正相關(guān)(P<0.05),r分別為0.684、0.756、0.740、0.732。肝組織PDGF-BB與血清PCⅢ、CⅣ、HA、LN水平呈正相關(guān)(P<0.05),r分別為0.681、0.692、0.785、0.720。肝組織CTGF與血清PCⅢ、CⅣ、HA、LN水平呈正相關(guān)(P<0.05),r分別為0.655、0.740、0.732、0.725。

3討論

在關(guān)于肝纖維化發(fā)生機(jī)制及治療靶點(diǎn)的研究中，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)是學(xué)者研究的重點(diǎn)。研究[7]表明，TGF-β1、PDGF-BB、CTGF在肝纖維化過程中發(fā)揮重要作用。TGF-β1在肝臟中含量較高，與肝纖維化關(guān)系較密切[8]。肝損傷期間，ECM沉積和降解的動(dòng)態(tài)平衡被打破, TGF-β1能夠抑制ECM降解，并促進(jìn)其合成，對(duì)肝細(xì)胞再生具有抑制作用[9]。TGF-β1通過與肝纖維化相關(guān)細(xì)胞因子及各種酶類相互作用而引發(fā)肝纖維化，在肝纖維化的啟動(dòng)、進(jìn)展過程中發(fā)揮核心作用[10]。肝細(xì)胞外基質(zhì)的主要產(chǎn)生細(xì)胞是HSC, TGF-β1能夠激活靜態(tài)的HSC, 轉(zhuǎn)換其表型，使HSC膜上巨球蛋白受體表達(dá)增加，從而進(jìn)一步增加TGF-β1的表達(dá)水平[11]; 同時(shí)，其還能增加ECM受體在HSC膜上的表達(dá)。研究[12]發(fā)現(xiàn)，肝病患者肝組織中TGF-β1表達(dá)水平顯著高于健康人群，且TGF-β1升高程度與肝纖維化程度呈正相關(guān)。本研究結(jié)果也證實(shí), CHB患者肝組織中TGF-β1水平與肝纖維化程度呈顯著正相關(guān), S0期未見明顯TGF-β1陽性染色物質(zhì)，S1、S2期僅在肝血竇周細(xì)胞、炎癥壞死灶周圍出現(xiàn)，表明在肝纖維化早期, TGF-β1主要來源于肝間質(zhì)細(xì)胞; S4、S3期TGF-β1陽性表達(dá)主要分布于纖維間隔，表明肝纖維化發(fā)展至后期, TGF-β1主要來源于肝細(xì)胞?？梢姡贑HB纖維化發(fā)生過程中，各個(gè)分期均有TGF-β1表達(dá)，且其表達(dá)部位與纖維化發(fā)生部位一致，進(jìn)一步說明TGF-β1促進(jìn)了肝纖維化的形成。

PDGF-BB具有刺激特定細(xì)胞群分裂、增殖的能力[13]。體內(nèi)主要由單核巨噬細(xì)胞分泌，當(dāng)肝臟受傷時(shí)，巨噬細(xì)胞、血小板、炎癥細(xì)胞、激活的HSC等均可分泌PDGF-BB。研究[14]證實(shí)，在纖維化過程中, PDGF-BB能夠使處于靜止期的G0細(xì)胞進(jìn)入G1、S1期，從而進(jìn)行DNA復(fù)制。本研究發(fā)現(xiàn)，PDGF-BB陽性染色主要位于細(xì)胞漿, S0期未見明顯陽性染色, S1、S2期主要分布于肝竇壁細(xì)胞、肝細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞, S3、S4期主要表達(dá)于纖維間隔區(qū)，且著色較深。研究[15]發(fā)現(xiàn)，肝炎肝硬化患者PDGF-BB表達(dá)水平明顯高于CHB患者，且隨肝纖維化程度的加重而增加。本研究中，PDGF-BB表達(dá)水平從S0期到S4期逐漸升高，證實(shí)了PDGF-BB在促肝纖維化形成中發(fā)揮了重要作用。

CTGF通過誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的增殖和分泌ECM, 來參與細(xì)胞增生以及傷口愈合的過程[16]。其主要來源細(xì)胞是HSC, 同時(shí)HSC活化也需要CTGF表達(dá)上調(diào)等因素。有研究[17]表明，肝炎肝硬化患者CTGF表達(dá)水平明顯高于CHB患者，肝纖維化程度越高，CTGF表達(dá)水平越高?？梢奀TGF在肝組織中的表達(dá)與肝纖維化嚴(yán)重程度密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，CTGF染色強(qiáng)度隨肝纖維化程度的加重而增強(qiáng)。作為促纖維化因子, CTGF通過促進(jìn)HSC增殖、活化來參與肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，肝組織中TGF-β1、PDGF-BB、CTGF水平與血清肝纖維化指標(biāo)水平成正相關(guān)，說明TGF-β1、PDGF-BB、CTGF與肝纖維化指標(biāo)的聯(lián)合檢測(cè)有助于診斷CHB的肝纖維化。

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收稿日期:2016-04-03

基金項(xiàng)目:中國高校醫(yī)學(xué)期刊臨床專項(xiàng)資金(11527743)

中圖分類號(hào):R 512.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2016)13-059-05

DOI:10.7619/jcmp.201613017

Expression and significance of TGF-β1,PDGF-BB and CTGF in the liver tissue of patients with chronic hepatitis B

GUO Qian, NONG Cunli

(1.DepartmentofInfectiousDiseases,FourthAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Liuzhou,Guangxi, 545005)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the expression and significance of transforming growth factor-β1(TGF-β1), platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) and connective tissue growth factor (CTGF) in the liver tissue of patients with chronic hepatitis B (CHB) at different stages of liver fibrosis.MethodsEighty patients with CHB were divided into groups S0, S1, S2, S3 and S4 according to chronic hepatitis staging standards.The immunohistochemical staining of TGF-β1, PDGF-BB and CTGF in the liver tissue was observed in each group.The contents of TGF-β1, PDGF-BB and CTGF in the liver tissue as well as levels of serum procollagen Ⅲ (PCⅢ), collagen Ⅳ (CⅣ), hyaluronic acid (HA) and laminin (LN) were all compared in each group, and the relationships between TGF-β1, PDGF-BB and CTGF levels and serum liver fibrosis-related indexes were also analyzed.ResultsThe immunohistochemical staining results of TGF-β1, PDGF-BB and CTGF and comparison of their levels revealed that the levels of TGF-β1, PDGF-BB and CTGF in the liver tissue were all associated with the degree of liver fibrosis, and increased with the degree of liver fibrosis exacerbation.The levels of serum PCⅢ, CⅣ, HA and LN gradually elevated from groups S0 to S4, and the differences were statistically significant among groups (P<0.01).Correlation analysis showed that the levels of TGF-β1, PDGF-BB and CTGF in the liver tissue were all positively correlated with levels of serum PCⅢ, CⅣ, HA and LN (P<0.05).ConclusionAt different stages of liver fibrosis, the levels of TGF-β1, PDGF-BB and CTGF in the liver tissue increase with the degree of liver fibrosis

exacerbation, which is of great importance in the early diagnosis of liver fibrosis.

KEYWORDS:transforming growth factor-β1; platelet-derived growth factor-BB; connective tissue growth factor; chronic hepatitis B