朱武政，林亞秋，江明鋒，王　永*，廖紅海，李　倩，朱江江

(1.西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省重點實驗室，成都 610041)

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肉用山羊脂代謝相關基因與肌內脂肪含量的相關性分析

朱武政1，2，林亞秋1，江明鋒1，2，王永1，2*，廖紅海1，2，李倩1，2，朱江江2

(1.西南民族大學生命科學與技術學院，成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省重點實驗室，成都 610041)

摘要：本研究旨在鑒定脂代謝相關基因在不同肉用山羊品種肌肉組織中的表達水平，并分析其與肌內脂肪(IMF)含量的相關性，從而為研究山羊肌肉IMF的形成機制奠定基礎。選取健康的簡州大耳羊和成都麻羊成年羯羊各6只，屠宰后分別采集背最長肌、后腿股二頭肌及臂三頭肌，利用實時熒光定量PCR技術檢測脂代謝相關基因的表達水平，同時測定肌肉中IMF的含量，分析基因表達水平與IMF含量之間的相關性。結果表明，除PPARG外，脂代謝相關基因(包括SREBP1c、THRSP、INSIG1、ACACA、SCD1、DGAT1和DGAT2)在簡州大耳羊各肌肉組織中的mRNA表達量普遍高于成都麻羊，其中THRSP、SCD1、DGAT2的表達量在各組織中均顯著高于成都麻羊(P<0.05)。除ACACA外，簡州大耳羊背最長肌的基因表達量均顯著高于其他兩種組織，而后腿股二頭肌和臂三頭肌間差異均不顯著(P>0.05)(除PPARG外)。除THRSP和SCD1在背最長肌中具有更高的mRNA表達外(P<0.05)，成都麻羊脂代謝相關基因表達水平在不同肌肉組織中均無顯著差異(P>0.05)。簡州大耳羊各組織中的IMF含量均顯著高于成都麻羊(P<0.05)，背最長肌在不同山羊品種間均具有最高的IMF含量(P<0.05)。THRSP、DGAT2和SCD1在成都麻羊和簡州大耳羊3個不同部位肌肉組織中的表達與IMF含量均存在顯著正相關。這些數(shù)據(jù)表明，THRSP、SCD1和DGAT2在肉用山羊肌肉IMF沉積過程中具有重要的調控作用，也為進一步揭示IMF形成調控機制奠定了基礎。

關鍵詞：肉用山羊；脂肪沉積；IMF；相關性

在過去的幾十年中，家畜育種主要集中在提高動物生長速度和產(chǎn)肉量上，卻忽視了肉質的品質，從而導致在生長速度和產(chǎn)量提高的同時，肉質顯著下降。近年來隨著人們消費水平的提高和對綠色、健康生活飲食的倡導，羊肉因為味美、低膽固醇以及營養(yǎng)豐富而越來越深受人們的喜愛[1-3]。肌內脂肪(IMF)作為肉質的一種重要經(jīng)濟性狀，對肉的嫩度、風味以及多汁性等性狀均有著積極的影響[4]。因此，了解IMF在肌肉中的沉積機制對于提高和改善山羊肉質有著重要意義。

山羊脂質的沉積是受到復雜的基因網(wǎng)絡調控的。細胞體內脂質的合成是從脂肪酸的攝取和從頭合成開始的。研究表明，過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARG)[5-6]和固醇調節(jié)元件結合蛋白(SREBP1)[7-8]是脂肪酸代謝兩個重要的調控因子。H.B.Shi等發(fā)現(xiàn)，PPARG可通過結合在基因的啟動子上從而促進ADRP和硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD1)mRNA的表達[5，9]。許會芬等研究表明SREBP1c過表達可顯著影響山羊乳腺細胞中脂肪酸代謝相關基因的表達[10]。M.Bionaz等通過篩選奶牛脂肪酸代謝的關鍵基因發(fā)現(xiàn)在所篩選的45個脂代謝相關基因中PPARG和SREBP1c處于核心的地位[11]，可見PPARG和SREBP1c在脂質代謝調控中具有重要作用。SREBP1需要通過與SCAP結合形成復合體從而進入細胞核中發(fā)揮作用[12]，而當SCAP與胰島素誘導基因(INSIG1)結合以后則可阻止SCAP-SREBP復合體脫離內質網(wǎng)面從而抑制SREBP1的轉運和活化[13]。此外甲狀腺激素應答蛋白(THRSP)也可通過與SREBP1c協(xié)同作用從而調控脂質的合成和分泌[7]。乙酰輔酶A羧化酶(ACACA)[14]、脂肪酸合酶(FASN)[15]和SCD1[16-17]等基因則負責了脂肪酸從頭合成和去飽和的關鍵步驟，在脂肪酸結合蛋白(FABPs)的轉運作用下進入內質網(wǎng)[11]，最終由甘油三酯合成酶(DGATs)催化合成成熟的甘油三酯[18]。因而研究清楚這些脂代謝基因在山羊脂質沉積特別是IMF形成過程中的作用具有重要的現(xiàn)實意義。然而現(xiàn)在卻很少有這些基因調控IMF形成的相關報道。

本研究中，利用實時定量PCR技術鑒定了脂代謝相關基因在不同山羊品種不同肌肉組織中的表達水平，同時分析其mRNA表達水平與IMF含量之間的相關性。這些數(shù)據(jù)將為鑒定山羊肌肉組織IMF沉積的關鍵調控基因提供試驗依據(jù)，也為進一步揭示IMF形成機制奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

QuantiTect Reverse Transcription Kit和QuantiFastTMSYBR?Green PCR Kit均購于QIAGEN公司，pMD-19T Vector購于大連TaKaRa公司，Trizol購自Invitrogen公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(AxyPrep DNA Gel Extraction Kit)購自Axygen公司，2×Taq PCR Master Mix購自天根生化科技有限公司，DH5α感受態(tài)細胞為本實驗室自制。質粒小提試劑盒、苯酚、氯仿、異丙醇、酒精等其他試劑均購自北京天根生化科技有限公司。

1.2試驗動物

于四川丘區(qū)選取健康的簡州大耳羊、成都麻羊的成年羯羊各6只，采用全舍飼管理、自由采食，兩品種日糧組成均為玉米、麩皮、豆粕、菜粕等。試驗前于清晨空腹屠宰，迅速采集背最長肌、后腿股二頭肌和臂三頭肌3個部位的肌肉組織樣品，經(jīng)DEPC水清洗后，迅速裝入無RNA酶的冷凍管中并立即置于液氮中保存用于組織總RNA的提取。另取背最長肌、后腿股二頭肌和臂三頭肌樣各150 g，于-20 ℃保存，用于IMF含量測定。

1.3引物設計

根據(jù)GenBank上公布的山羊的基因序列，采用Primer5.0軟件設計目的基因的熒光特異性引物，引物由北京華大基因科技股份有限公司合成，引物序列及相關信息見表1。在進行正式試驗之前，所有的引物都經(jīng)過PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。另外，通過梯度qPCR確定目的基因的最佳退火溫度，并通過熔解曲線觀察內參引物的特異性。以純化后的PCR產(chǎn)物為模板，進行10倍連續(xù)梯度稀釋建立標準曲線。

表1　基因RT-qPCR引物匯總表

1.4總RNA提取及實時熒光定量PCR (RT-qPCR)

利用Trizol法提取組織總RNA，并用1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。采用NanoDrop ND-1000 (Agilent) 分光光度計測定RNA樣品的濃度以及A260 nm/A280 nm比值，并控制A260 nm/A280 nm值在1.9～2.1。gDNAse去除基因組DNA后，利用QuantiTect Reverse Transcription Kit進行cDNA鏈的合成。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測cDNA的質量。利用CFX96 實時定量PCR儀(美國伯樂)測定脂代謝相關基因的表達水平，定量程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，39個循環(huán)。熔解曲線分析：95 ℃ 10 s，然后以0.5 ℃/5 s 的速度從55 ℃升到95 ℃。每個品種為6個生物學重復，每個待測樣本設3個技術重復，并設置3個無cDNA模板的樣本為陰性對照。

將PCR擴增后的產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，切膠回收DNA片段。連接pMD-19T載體后轉化DH5α感受態(tài)細胞，提取質粒后送深圳華大基因科技股份有限公司測序，確定引物擴增序列的正確性(表2)。

表2　RT-qPCR產(chǎn)物序列

1.5肌內脂肪含量的測定

將采回的肌肉樣品從-20 ℃冰箱取出于常溫解凍，去除覆蓋在肌肉上的脂肪組織、黏膜以及其他結締組織，用索氏提取法測定其脂肪含量，最終計算得到IMF的相對含量。

1.6數(shù)據(jù)分析

肽基脯氨酰異構酶B(PPIB)、核糖體蛋白P0(RPLP0)和羥甲基膽色烷合酶(HMBS)作為內參基因[19]，采用2-△△Ct法對實時定量PCR數(shù)據(jù)進行均一化處理并計算基因的相對表達量，并用2-△Ct法對數(shù)據(jù)處理并用于相關性分析。用SAS 9.0中的PROC ANOVA程序對試驗結果進行二因素交叉分組等重復資料方差分析，采用Duncan法對各組織間mRNA表達的主效應進行多重比較。采用PROC CORR程序對候選基因mRNA表達量與IMF含量進行相關分析。

2結果

2.1脂代謝相關基因在不同山羊品種間的組織表達分析

PPARG基因在兩個品種不同部位肌肉組織中的總體表現(xiàn)均為(圖1A)：背最長肌>后腿股二頭肌>臂三頭肌，成都麻羊背最長肌中的表達量顯著(P<0.05)高于其他兩個部位肌肉組織中的表達，但后腿股二頭肌和臂三頭肌之間差異不顯著。簡州大耳羊不同肌肉組織間具顯著差異，且基本上都高于成都麻羊相同部位肌肉組織的表達水平(背最長肌除外)。

不同字母表示其差異顯著(P<0.05)，下同The different letters means significant difference(P<0.05)，the same as below圖1　脂代謝相關基因在不同山羊品種間的組織表達分析Fig.1　Tissue expression of genes related to lipid metabolism in different goat breeds

相對于成都麻羊，簡州大耳羊背最長肌具有更高的SREBP1c的mRNA表達水平(P<0.05)，且顯著高于其他兩個部位(P<0.05)，SREBP1c在兩個品種不同部位組織間均無顯著差異(P>0.05)(簡州大耳羊背最長肌除外)。這與INSIG1(圖1D)和DGAT2(圖1H)基因在兩種山羊品種中的表達情況一致。

相對于成都麻羊，THRSP在簡州大耳羊均具有相同組織中更高的表達水平(P<0.05)，而兩種山羊品種在背最長肌中的表達水平均顯著高于其他兩種組織(P<0.05)，但在后腿股二頭肌和臂三頭肌之間并無顯著差異(圖1C)。這與DGAT1(圖1G)(除后腿股二頭肌在不同物種間差異不顯著外) 和SCD1(圖1F)在兩種品種不同組織中的表達趨勢一致。

在簡州大耳羊中，ACACA基因的表達趨勢為后腿股二頭肌>背最長肌>臂三頭肌，在成都麻羊中表現(xiàn)為背最長肌>后腿股二頭肌>臂三頭肌。但ACACA在品種與組織間的差異均不顯著(P>0.05)(圖1E)。

2.2不同山羊品種肌內脂肪含量測定

簡州大耳羊3個部位肌肉組織中的IMF含量均顯著(P<0.05)高于成都麻羊相應部位肌肉組織中的IMF含量。兩個品種內IMF含量均表現(xiàn)為：背最長肌>后腿股二頭肌>臂三頭肌，并且背最長肌中的IMF含量顯著高于其他兩個部位肌肉組織中的IMF含量，但后腿股二頭肌和臂三頭肌之間的IMF含量差異不顯著(圖2)。

圖2　不同山羊品種組織IMF測定Fig.2　Tissue IMF content in different goat breeds

2.3脂代謝相關基因mRNA表達與IMF含量的相關分析

SCD1、DGAT2和THRSP3個基因在簡州大耳羊和成都麻羊中3個不同部位肌肉組織中的表達均與IMF有著顯著(P<0.05)的正相關。此外，ACACA基因在簡州大耳羊背最長肌中的表達與IMF含量呈極顯著(P<0.01)的正相關；PPARG基因在簡州大耳羊臂三頭肌中的表達與IMF含量呈顯著(P<0.05) 的正相關，而在成都麻羊臂三頭肌中的表達與IMF含量呈負相關，但未達到顯著水平。INSIG1、DGAT1和SREBP1c3個基因在簡州大耳羊和成都麻羊不同肌肉組織中表達量與IMF含量均無顯著相關性(表3)。

3討論

簡州大耳羊是由努比亞山羊與四川省簡陽市本地山羊雜交培育形成的肉用山羊新品種，是我國第二個國家級肉羊品種，該品種具有生長速度快、產(chǎn)肉性能優(yōu)良、繁殖性能高、體格大、遺傳性能穩(wěn)定、耐粗飼、適應性好等優(yōu)點，是四川地區(qū)重要的肉用山羊品種。成都麻羊又名四川銅羊，是我國有名的肉、乳、皮兼用型地方良種，主要分布于成都市近郊的雙流、龍泉、大邑等地，是四川地區(qū)重要的羊肉來源。通過比較兩種山羊不同肌肉組織IMF的含量及與脂代謝相關基因表達水平相關性，為揭示四川地區(qū)山羊肌內脂肪沉積的特點及其調控機制具有重要意義，這也為未來四川地區(qū)肉用山羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定基礎。

IMF是衡量山羊肉品質重要指標，與羊肉嫩度和口感有很大關系，因此研究IMF形成的分子調控機制具有重要的現(xiàn)實意義?，F(xiàn)在，雖然已經(jīng)有很多關于脂代謝基因功能的研究報道[20]，然而關注肉用山羊肌肉IMF沉積調控機制的研究卻并不多見。本研究以簡州大耳羊和成都麻羊為研究對象，通過比較脂代謝相關基因在不同山羊品種和組織間的表達量差異，并分析其與IMF沉積的相互關系，這將為IMF沉積關鍵調控基因的篩選提供試驗依據(jù)。

PPARG和SREBP是脂代謝調控過程中的關鍵基因[11]，L.Li等對南江黃羊發(fā)育早期PPARG的mRNA表達規(guī)律與IMF含量變化進行相關分析顯示，PPARG基因在背最長肌、半腱肌和臂三頭肌中的表達均存在差異，并且PPARG基因的mRNA表達與IMF含量存在顯著(P<0.05)負相關[21]，這與本研究結果一致。但本研究中僅簡州大耳羊臂三頭肌中PPARG的表達與IMF呈顯著(P<0.05) 的正相關，而在成都麻羊臂三頭肌中與IMF呈負相關，且未達到顯著水平。李健發(fā)現(xiàn)，PPARG基因在6和24月齡表達量與西雜牛IMF呈負相關，而在12和36月齡與IMF呈正相關，且均未達到顯著水平[22]。此外，Z.G.Huang等對雄性哈薩克羊和新疆細毛羊PPARG基因mRNA表達的發(fā)育性變化與IMF含量進行相關分析顯示，雄性哈薩克羊PPARG基因mRNA表達趨勢與IMF含量變化相反，而在新疆細毛羊中卻未見顯著相關性[23]。可見PPARG表達與IMF的相關性可能與品種和年齡因素相關，這可能是造成本結果的原因。

表3　兩個山羊品種肌肉組織中基因表達與IMF含量的相關性

*.P<0.05；**.P<0.01

作為細胞中單不飽和脂肪酸和共軛亞油酸合成的關鍵酶[24]，SCD1在不同品種和組織中的表達量與IMF含量之間具有顯著的正相關性，這與金世杰等在延邊黃牛上的研究結果一致[25]，表明SCD1基因可以作為調控山羊IMF形成的候選基因，并且該基因可能對IMF沉積有著積極的作用。

DGATs是動物體內甘油三酯合成的關鍵酶，其主要有DGAT1和DGAT2兩種形式，均可催化合成甘油三酯。然而，本研究中僅DGAT2與IMF合成具有顯著相關性。C.A.Harris等推測DGAT2主要接受內源脂肪酸合成甘油三酯，而DGAT1則主要利用外源的脂肪酸[18]。從本研究的數(shù)據(jù)也可看出，DGAT2在兩種山羊各組織中均具有更高的表達量(P<0.05)。雖然現(xiàn)在對于IMF脂肪酸的利用機制還不是很清楚，但無疑本研究顯示DGAT2可能在IMF沉積調控過程中具有更為重要的作用。

雖然THRSP和SREBP1c均被認為是脂肪酸代謝的重要調控因子[7，26-27]，然而與SREBP1c不同的是，THRSP的表達水平在不同品種山羊各肌肉組織中與IMF均具有顯著的正相關性，這與綿羊和牛中的研究結果一致[28]。這說明與乳腺的代謝機制不同，THRSP才是肌肉脂代謝的關鍵調控因子，通過體外培養(yǎng)肌內脂肪細胞從而驗證THRSP對脂質積累的影響將有助于更好的解釋THRSP在IMF沉積中的作用。

W.Z.Zhu等發(fā)現(xiàn)常用的內參基因如甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、肌動蛋白(Actin)等在不同肌肉組織中的表達變異較大，從而影響分析結果的準確性，因此通過篩選得到了3個較為穩(wěn)定的內存基因[19]，這與A.K.Kadegowda等的結果一致[29-30]。因此使用3個內參基因被認為是一種更可靠的定量數(shù)據(jù)標準化的方法。本試驗中使用PPIB、RPLP0和HMBS等3個基因作為內參更大程度的減少由于內參變異所導致的分析誤差。

4結論

簡州大耳羊較成都麻羊具有更高的IMF含量，其脂代謝相關基因的表達水平更高。背最長肌在各肌肉組織中的IMF含量最高。THRSP、SCD1和DGAT2在肉用山羊肌肉組織IMF沉積過程中具有重要的調控作用。

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(編輯郭云雁)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.005

收稿日期：2015-12-08

基金項目：四川省科技創(chuàng)新產(chǎn)業(yè)鏈示范工程重大項目(2014NZ0003)；四川省畜禽育種攻關項目(2016NZ0099-36)；四川省基礎研究項目(2016JY0147)

作者簡介：朱武政(1988-)，男，湖南常德人，博士生，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail: zhuwuzheng8@163.com *通信作者：王永，博士，教授，博士生導師，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail: wangyong010101@swun.cn

中圖分類號：S827；S813.3

文獻標志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)07-1333-09

Association Analysis of Intramuscular Fat Content and the Expression of Genes Related to Lipid Metabolism in Meat Goat

ZHU Wu-zheng1，2，LIN Ya-qiu1，JIANG Ming-feng1，2，WANG Yong1，2*，LIAO Hong-hai1，2，LI Qian1，2，ZHU Jiang-jiang2

(1.CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China；2.KeyLaboratoryofSichuanProvinceforQinghai-TibetanPlateauAnimalGeneticResourceReservationandExploitation，Chengdu610041，China)

Abstract:The aim of this study was to determine the mRNA expression of genes related to lipid metabolism in muscle tissue of different goat breeds，and to analyze their association with intramuscular fat (IMF) content，which was predicted to provide basic data for revealing the mechanism underlying IMF formation.Longissimus dorsi，biceps femoris muscle and triceps brachii muscle from 6 healthy castrated Jianzhou Big-eared goats and Chengdu Brown goats after slaughter，respectively，were collected for detecting IMF content，and the real-time PCR was used to detect the mRNA expression of genes related to lipid metabolism，and their association was analyzed.The result showed that，except for PPARG，the other lipid metabolism related genes(including SREBP1c， THRSP， INSIG1，ACACA，SCD1，DGAT1 and DGAT2) were expressed higher in Jianzhou Big-eared goat than in Chengdu Brown goat.Among them，the expression of THRSP，SCD1 and DGAT2 were significantly higher in Jianzhou Big-eared goat than in Chengdu Brown goat in different tissues (P<0.05).Except for ACACA，the expression of other lipid metabolism related genes were the highest in longissimus dorsi of Jianzhou Big-eared goat，with no significant difference between biceps femoris muscle and triceps brachii muscle (P>0.05) (except for PPARG).While the mRNA expression of THRSP and SCD1 were the highest in longissimus dorsi (P<0.05)，the lipid metabolism related genes had no significant differences between biceps femoris muscle and triceps brachii muscle in Chengdu Brown goat (P>0.05).Jianzhou Big-eared goat had higher IMF content than Chengdu Brown goat in all the 3 tissues (P<0.05)，longissimus dorsi had higher IMF content compared with the other tissues.THRSP，DGAT2 and SCD1 showed positive association with IMF in various tissues of Jianzhou Big-eared goat and Chengdu Brown goat.These results indicate that THRSP，SCD1 and DGAT2 may play important role in promoting fat deposition in meat goat，and also provide basic data for revealing the mechanism underlying goat IMF formation.

Key words:meat goat；fat deposition；IMF；association