劉　珂　杜景霞　阮林海

(河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，洛陽(yáng)471003)

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急性白血病患者M(jìn)SC的免疫原性及抑制異體T淋巴細(xì)胞增殖功能和機(jī)制研究

劉珂杜景霞①阮林海

(河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，洛陽(yáng)471003)

[摘要]目的：研究分析急性白血病患者的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(MSC)對(duì)異體T淋巴細(xì)胞增殖功能的抑制作用及其作用機(jī)制。方法：選取30例確診急性髓細(xì)胞白血病(AML組)患者及30例急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL組)，同期健康研究對(duì)象30例(健康組)，分離培養(yǎng)三組研究對(duì)象的MSC細(xì)胞，測(cè)定三組MSC細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子的表達(dá)水平，采用Transwell培養(yǎng)檢測(cè)三組MSC對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用，采用混合淋巴細(xì)胞方法檢測(cè)MSC對(duì)異體T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用。結(jié)果：AML組上清液中的TGF-β1、HGF水平顯著低于ALL組和健康組(P<0.05)，ALL組的IL-11水平顯著高于AML組、健康組(P<0.05)；三組間MSC上清液中IL-6的水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AML、ALL、健康組的MSC細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖仍然具有顯著的抑制作用，接觸性共培養(yǎng)和不直接接觸的情況下對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在加入MSC后，三組的T細(xì)胞增殖作用受到顯著的抑制，在加入抗TGF-β1抗體、抗HGF抗體后T細(xì)胞增殖抑制作用較單純加入MSC時(shí)明顯降低(P<0.05)。 結(jié)論：急性白血病患者的MSC對(duì)異體T淋巴細(xì)胞增殖具有抑制作用，其作用原理可能與細(xì)胞因子的分泌有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]急性白血病；骨髓間充質(zhì)細(xì)胞；異體；T淋巴細(xì)胞；增殖；抑制作用

骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(Mesenchymal cells,MSC)為具有潛在干細(xì)胞分化成熟能力的骨髓細(xì)胞，在定向誘導(dǎo)分化的情況下可以分化為骨、軟骨、筋膜以及其他間質(zhì)成分。MSC在骨髓中具有調(diào)節(jié)造血細(xì)胞分化、穩(wěn)定造血速度以及原始早幼或者晚幼細(xì)胞的功能，對(duì)于正常的骨髓造血具有較為重要的意義。近年來(lái)，相關(guān)研究證實(shí)，MSC能夠增加機(jī)體免疫耐受、抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的異體源性免疫反應(yīng)[1,2]，其機(jī)制可能與分泌不同細(xì)胞調(diào)節(jié)因子有關(guān)，但具體機(jī)制仍然不清。迄今為止對(duì)于骨髓異常造血情況下MSC能夠參與免疫耐受的調(diào)節(jié)以及其機(jī)制的研究較少。急性白血病主要包括急性髓性、淋巴細(xì)胞性以及粒細(xì)胞性白血病，對(duì)于不同白血病的根治性治療主要依靠異體骨髓移植。白血病異常病理造血情況下的MSC的免疫耐受的機(jī)制研究有利于延長(zhǎng)骨髓抑制后抑制免疫排斥反應(yīng)，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景[3]。本研究重在探討MSC對(duì)異體T淋巴細(xì)胞增殖功能的抑制作用及其作用機(jī)制。

1資料與方法

1.1一般資料選取30例確診急性髓細(xì)胞白血病(AML組)患者及30例急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL組)，同期健康研究對(duì)象30例(健康組)，AML組30例，其中男18例、女12例，年齡21～58歲，平均年齡(35.4±11.6)歲，依據(jù)形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)及免疫學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)：M1 5例、M2 9例、M3 8例、M4 3例、M5 5例。ALL組30例，其中男17例、女13例，年齡19～55歲，平均年齡(33.6±10.9)歲，其中L1 11例、L2 19例。健康組30例，其中男15例、女15例，年齡19～56歲，平均年齡(35.2±12.0)歲。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1MSC分離培養(yǎng)方法自髂后上棘抽取骨髓，加入淋巴細(xì)胞分離液，1 000 r/min離心20 min，獲取全部單個(gè)核細(xì)胞，計(jì)數(shù)后接種于含40%MCDB、20 g/L血清的DF2培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后換液，去除未貼壁細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)，應(yīng)用胰酶/EDTA消化后，按照1∶3的比例傳代。采用PRIM含10%的胎牛血清的培養(yǎng)基，加入尼龍柱內(nèi)后采用培養(yǎng)基沖出非黏附細(xì)胞為T淋巴細(xì)胞，將MSC注入96孔板內(nèi)，加入2×108L-1的T淋巴細(xì)胞100 μl，給予植物血凝素刺激T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

1.2.2MSC上清液中細(xì)胞因子測(cè)定應(yīng)用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、白細(xì)胞介素11(IL-11)和IL-6酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)原代AML、不同代數(shù)ALL和正常成人骨髓MSC培養(yǎng)上清中上述細(xì)胞因子的水平。

2結(jié)果

2.1MSC的培養(yǎng)情況經(jīng)過(guò)2周培養(yǎng)，AML組、ALL組及健康組均成功分離出MSC細(xì)胞，在倒置相差顯微鏡下觀察，MSC細(xì)胞表現(xiàn)為梭形，均平行排列呈漩渦樣生長(zhǎng)，核仁明顯，圖1分別為AML組、ALL組及健康組的MSC培養(yǎng)后的MSC貼壁生長(zhǎng)效果圖。

2.2三組MSC上清液中細(xì)胞因子分泌情況AML組上清液中的TGF-β1、HGF水平顯著低于ALL組和健康組(P<0.05)，ALL組的IL-11水平顯著高于AML組、健康組(P<0.05)；三組間MSC上清液中IL-6的水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表1。

2.3MSC對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用觀察在不同數(shù)量的MSC細(xì)胞下，三組MSC對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用見表2，AML組、ALL組及健康組三組的在MSC細(xì)胞數(shù)量逐漸增加的情況下，對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖抑制作用均逐漸增強(qiáng)，ALL組MSC對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖抑制作用與健康組基本一致，AML組MSC對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用顯著弱于ALL組和健康組(P<0.05)。

2.4MSC分泌細(xì)胞因子對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用觀察在Transwell培養(yǎng)的情況下，MSC細(xì)胞不能與T淋巴細(xì)胞進(jìn)行直接接觸，但是AML、ALL、健康組的MSC細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖仍然具有顯著的抑制作用，接觸性共培養(yǎng)和不直接接觸的情況下對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表3)。

2.5MSC細(xì)胞因子抗體對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用觀察在未加入MSC及細(xì)胞因子抗體的情況下，AML、ALL、健康組T細(xì)胞增殖作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在加入MSC后，三組的T細(xì)胞增殖作用受到顯著的抑制，在加入抗TGF-β1抗體、抗HGF抗體后T細(xì)胞增殖抑制作用較單純加入MSC時(shí)明顯降低(P<0.05，表4)。

圖1　MSC培養(yǎng)情況(×200)Fig.1　MSC culture(×200)Note: A.AML group；B.ALL group；C.Health group.

GroupsnTGF-β1IL-6IL-11HGFAMLgroup30358.62±36.9754.82±13.0878.14±11.082)220.74±65.17ALLgroup30568.91±55.481)59.17±14.05102.95±25.61650.18±114.911)Healthgroup30580.35±72.611)65.27±17.0388.25±17.052)641.87±120.861)

Note：Compared with AML group，1)P<0.05；compared with ALL group，2)P<0.05.

GroupsNoMSCgroup0.5×1041.0×1042.0×1045.0×104AMLgroup4.02±0.713.58±0.602.89±0.622)1.80±0.592)1.15±0.202)ALLgroup3.84±0.691.96±0.321)1.58±0.301)2)0.92±0.211)2)0.21±0.111)2)Healthgrou3.92±0.772.01±0.371)1.64±0.331)2)1.00±0.231)2)0.25±0.121)2)

Note：Compared with AML group，1)P<0.05；comparison with the the number of MSC cells was 0.5×104，2)P<0.05.

TranswellcultureNoMSCgroupAMLgroupALLgroupHealthgroupDirectcontact4.06±0.510.89±0.201)1.96±0.251)1.25±0.161)Contactcoculture4.12±0.600.91±0.221)1.92±0.231)1.20±0.191)t0.4170.3680.6451.12P>0.05>0.05>0.05>0.05

Note：Compared with the case without MSC，1)P<0.05.

GroupsNoMSCMSCMSC+antiIL-11antibodyMSC+antiIL-6antibodyMSC+antiTGF-β1MSC+antiHGFantibodyAMLgroup4.06±0.641.12±0.201)1.18±0.191)1.16±0.201)2.91±0.411)2)3.42±0.451)2)ALLgroup4.11±0.811.01±0.191)1.14±0.171)1.10±0.211)3.02±0.471)2)3.35±0.511)2)Healthgroup4.14±0.751.20±0.221)1.23±0.241)1.25±0.241)2.98±0.451)2)3.47±0.481)2)

Note：Compared with the case without MSC，1)P<0.05；compared with the addition of MSC，2)P<0.05.

3討論

急性白血病患者骨髓造血異常，過(guò)度非正常白血病造血不僅導(dǎo)致機(jī)體參與抗感染等過(guò)程的細(xì)胞數(shù)量減少。同時(shí)其對(duì)于正常血細(xì)胞、血小板等造血功能的抑制，往往造成全血細(xì)胞減少的臨床癥狀。重癥白血病患者可以因重度感染、顱內(nèi)出血以及繼發(fā)性彌漫性血管內(nèi)出血而死亡，異體骨髓移植為其治愈的唯一方式。抑制物抗宿主病是困擾骨髓移植的主要并發(fā)癥，嚴(yán)重的抗宿主病將導(dǎo)致患者出現(xiàn)急性血管型或者細(xì)胞型免疫反應(yīng)[4]，威脅白血病患者的生命安全。如何誘導(dǎo)免疫抑制、減輕抑制排斥反應(yīng)是血液科醫(yī)生關(guān)注的重要課題。雖然部分免疫抑制劑已廣泛應(yīng)用于骨髓移植后抗免疫排斥治療，但其長(zhǎng)期免疫誘導(dǎo)抑制的能力較弱，部分骨髓移植患者術(shù)后6個(gè)月之后出現(xiàn)了明顯的排斥反應(yīng)[5]。MSC不僅具有潛在干細(xì)胞分化功能，其對(duì)于造血細(xì)胞的免疫抑制、T淋巴細(xì)胞的共刺激抗原分子的沉默等作用[6]，還可在骨髓移植的同時(shí)進(jìn)行MSC移植治療[7,8]。但其治療效果尚無(wú)大規(guī)模研究證實(shí)。病理狀態(tài)下MSC對(duì)于淋巴細(xì)胞介導(dǎo)免疫的抑制作用以及相關(guān)機(jī)制的研究，對(duì)于骨髓移植具有極為重要的臨床應(yīng)用前景。

AML組、ALL組及健康組均成功分離出MSC細(xì)胞，在倒置相差顯微鏡下觀察，MSC細(xì)胞表現(xiàn)為梭形，均平行排列呈漩渦樣生長(zhǎng)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為清晰，細(xì)胞核以及細(xì)胞膜周邊膜性結(jié)構(gòu)較豐富，提示了MSC的典型形態(tài)。三組分離培養(yǎng)的MSC細(xì)胞均能夠貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞增殖活性較高，在無(wú)造血細(xì)胞存在的情況下，可以呈現(xiàn)集落式生長(zhǎng)。將自體骨髓MSC聯(lián)合外周血造血干細(xì)胞移植，自體MSC可以促進(jìn)受者造血，更為重要的是MSC對(duì)于移植物排斥反應(yīng)的抑制作用，但并未對(duì)于不同移植數(shù)量級(jí)的MSC細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量依賴性分析[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，AML組、ALL組及健康組均成功分離出MSC細(xì)胞對(duì)于淋巴細(xì)胞增殖均具有明顯抑制作用，在MSC數(shù)量逐漸增多的情況下，T淋巴細(xì)胞的增殖抑制作用均逐漸增強(qiáng)，提示了MSC對(duì)于淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)抑制作用。有趣的是，AML組MSC對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用較弱，AML骨髓MSC不表達(dá)HLA-DR和共刺激分子CD80、CD86和CIM0，其對(duì)于免疫誘導(dǎo)的抑制作用的下降可能與第一類以及第二類T細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)的免疫原性的下降有關(guān)[10]。骨髓增生極度活躍或明顯活躍，骨髓中原始粒細(xì)胞占30%～89%(非紅系)，早幼粒、中幼粒和成熟粒細(xì)胞比例較高，該病理特征的異常造血可能導(dǎo)致的免疫調(diào)控的病理改變[11]，但結(jié)論需要進(jìn)一步證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)，在Transwell培養(yǎng)的情況下，MSC細(xì)胞不能與T淋巴細(xì)胞進(jìn)行直接接觸，在接觸以及不接觸的情況下，三組MSC均具有明顯的T淋巴細(xì)胞抑制作用，提示了MSC可能通過(guò)分泌細(xì)胞因子發(fā)揮抑制T淋巴細(xì)胞增殖作用的，如Song等[12]學(xué)者認(rèn)為，MSC對(duì)于淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用與TGF-β1有關(guān)。為了證實(shí)這一觀點(diǎn)，本次研究加入抗TGF-β1抗體、抗HGF抗體后T細(xì)胞增殖抑制作用得到有效的逆轉(zhuǎn)作用，表明MSC通過(guò)細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，而TGF-β1和HGF是MSC發(fā)揮免疫抑制作用的主要分泌因子。

綜上所述，急性白血病患者的MSC對(duì)異體T淋巴細(xì)胞增殖具有抑制作用，AML、ALL白血病患者骨髓MSC對(duì)于免疫耐受的誘導(dǎo)作用具有MSC細(xì)胞數(shù)量的依賴性，同時(shí)病理狀態(tài)下MSC對(duì)于淋巴細(xì)胞的增殖抑制作用可能與TGF-β1和HGF等細(xì)胞因子的分泌有關(guān)。臨床上對(duì)于符合骨髓移植治療的白血病患者，在骨髓抑制的同時(shí)進(jìn)行MSC細(xì)胞體外培養(yǎng)移植，可以誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受，而TGF-β1和HGF等細(xì)胞因子的外源性加入可能進(jìn)一步加強(qiáng)MSC的抗免疫宿主病的作用，降低機(jī)體免疫排斥反應(yīng)，具有較為廣闊的臨床應(yīng)用前景，但需要大量以及長(zhǎng)期的臨床前期試驗(yàn)和論證。

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[收稿2015-10-09修回2015-11-18]

(編輯張曉舟)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.028

作者簡(jiǎn)介：劉珂(1976年-)，女，主治醫(yī)師，主要從事血液學(xué)方面的研究，E-mail：lllkkk_1976@sina.com。

中圖分類號(hào)R733.71

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)07-1056-04

Study on immune function and mechanism of T lymphocyte proliferation in patients with acute leukemia MSC

LIU Ke，DU Jing-Xia，RUAN Lin-Hai.

Department of Hematology，the First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China

[Abstract]Objective:To study the inhibitory effect of bone marrow mesenchymal stem cells (MSC) on the proliferation of allogeneic T lymphocytes in patients with acute leukemia and its mechanism.Methods: 30 patients with acute myeloid leukemia (AML),30 patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL),and 30 healthy subjects (healthy group) were selected.MSC cells were isolated and cultured in three groups.The expression level of MSC cells in three groups were determined by MSC assay.The inhibitory effect of MSC on the proliferation of T cells was detected by Transwell assay.Results: AML group supernatant TGF-β1,HGF levels were significantly lower than the ALL group and the healthy group (P<0.05),significantly higher than the levels of IL-11 ALL group of AML group,healthy group (P<0.05); three groups MSC supernatant IL-6 levels difference was not statistically significant (P> 0.05).AML,ALL,MSC cells secrete cytokines healthy group of T lymphocyte proliferation still had a significant inhibitory effect,inhibition of differences in the case of contact and not in direct contact co-culture of T lymphocyte proliferation was not statistically significant (P> 0.05); after joining the MSC,T cell proliferation in the three groups was significantly inhibited upon addition of anti-TGF-β1 antibody,anti-HGF antibody after T cell proliferation effective than a simple reversal join MSC (P<0.05).Conclusion: MSC for acute leukemia patients inhibit allogeneic T lymphocyte proliferation,functioning principle may be related to the secretion of cytokines.

[Key words]Acute leukemia;Bone marrow mesenchymal stem cells;Allogeneic;T lymphocyte;Proliferation;Inhibition

①河南科技大學(xué)，洛陽(yáng)471003。