黃慶生，林喬齡，郭逸爾（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬漳州市中醫(yī)院，福建 漳州 363000）

珍骨膠囊對(duì)兔關(guān)節(jié)退變軟骨細(xì)胞增殖的影響

黃慶生，林喬齡，郭逸爾
（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬漳州市中醫(yī)院，福建 漳州 363000）

目的研究珍骨膠囊含藥血清對(duì)新西蘭大白兔退變軟骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。方法用含藥血清、空白血清對(duì)大白兔退變軟骨細(xì)胞干預(yù)，用MTT法檢測(cè)含藥血清組、空白組對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果含藥血清組細(xì)胞隨血清濃度的增加而加快增殖速度，與同濃度空白血清組比較有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)論珍骨膠囊含藥血清能促進(jìn)體外培養(yǎng)退變軟骨細(xì)胞迅速進(jìn)入增殖周期，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖。

軟骨細(xì)胞；珍骨膠囊；細(xì)胞增殖

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1試劑與儀器Ⅱ型膠原酶、DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶、胎牛血清（新西蘭Hy-clone公司）；流式細(xì)胞分析儀（美國BD公司）；CO2培養(yǎng)箱（德國Heraus公司）；熒光倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)（日本Olympus公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇清潔級(jí)3月齡新西蘭大白兔6只，體質(zhì)量2.5 kg左右，隨機(jī)分成2組，即含藥血清組3只，空白血清組3只。

1.3藥物組成與來源珍骨膠囊由淫羊藿、肉蓯蓉、紫河車、黨參、田七、兩面針等組成，是福建省漳州市中醫(yī)院院內(nèi)制劑，由本院制劑室制備。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1制作珍骨膠囊含藥血清大白兔所用生物劑量按照人與動(dòng)物千克體質(zhì)量換算。大白兔每kg體質(zhì)量每日用藥2 g，2.5 kg大白兔每日用量5 g。以上藥粉以生理鹽水10 mL溶解灌服，每只大白兔每日灌胃2次，每日早8點(diǎn)、晚4點(diǎn)各1次。空白血清組灌服生理鹽水10 mL/d，2組連續(xù)灌胃3 d，在最后1次灌胃3 h后腹主動(dòng)脈抽取全血，離心后經(jīng)56℃水浴滅活后，再經(jīng)過過濾除菌，-20℃保存。

2.2制取退變關(guān)節(jié)的軟骨細(xì)胞

2.2.1動(dòng)物模型的準(zhǔn)備造模組采用改良 Hulth方法造模，取新西蘭大白兔3只，術(shù)前準(zhǔn)備，用氯胺酮靜脈麻醉，配合利多卡因局部浸潤麻醉，取兔右后肢膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)手術(shù)入路，顯露出內(nèi)側(cè)副韌帶，并將其切斷，開放關(guān)節(jié)囊去除內(nèi)側(cè)半月板及前交叉韌帶。術(shù)后3 d青霉素肌肉注射防止感染，每日2次，每日20萬U。手術(shù)后第7天，開始每日強(qiáng)迫大白兔活動(dòng)1次，每次500 m。

2.2.2關(guān)節(jié)退變軟骨細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)［1］手術(shù)后第8周，動(dòng)物處死后，消毒雙膝并離斷膝關(guān)節(jié)，剝離膝關(guān)節(jié)周圍附著的軟組織，包括韌帶、關(guān)節(jié)囊，切取關(guān)節(jié)表面的軟骨，剪成1 mm×1 mm大小，用0.25%胰蛋白酶于室溫下?lián)u床內(nèi)振蕩消化30 min，再用0.2%Ⅱ型膠原酶消化2次，收集消化所得的軟骨細(xì)胞懸液，并將（2～3）×105細(xì)胞/m L密度的軟骨細(xì)胞接種于有DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。每2天更換1次。培養(yǎng)過程中通過Ⅱ型膠原染色法鑒定關(guān)節(jié)退變軟骨細(xì)胞來準(zhǔn)確獲取。具體按照ABC法Ⅱ型膠原免疫組化染色，蘇木精襯染。染色后細(xì)胞胞漿呈棕黃色，染色陽性，提示有Ⅱ型膠原的表達(dá)。

2.3MTT法檢測(cè)不同濃度珍骨膠囊含藥血清對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響在48孔板中以2×103/孔接種F3細(xì)胞，貼壁后分別加入含 10%、15%、20%、30%含藥血清或生理鹽水空白血清的DMEM培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)12孔。培養(yǎng)72 h，放棄培養(yǎng)基，每孔加入10μL 0.5%MTT溶液，37℃溫度下培育4 h，棄除MTT，加入100μL DMSO，振蕩10 min，充分溶解晶化物。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀中，將波長測(cè)定為570 nm，然后測(cè)定各孔光吸收值（OD值），記錄結(jié)果。

2.4珍骨膠囊含藥血清干預(yù)退變的軟骨細(xì)胞后軟骨細(xì)胞周期的變化在培養(yǎng)皿中以1×105/mL傳代接種生長良好的第3代軟骨細(xì)胞，分別加入15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，細(xì)胞貼壁后，去除含有血清的培養(yǎng)基，加入單純DMEM培養(yǎng)液，饑餓24 h，使細(xì)胞同步化，即G0或G1期，再隨機(jī)分成含藥血清組和空白組，分別加入最佳濃度珍骨膠囊含藥血清的DMEM培養(yǎng)基和相應(yīng)濃度生理鹽水血清培養(yǎng)基，流式細(xì)胞分析儀分別檢測(cè)培養(yǎng)24、48、72 h后的軟骨細(xì)胞周期分布。

3　結(jié)果

3.1軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察貼壁的退變軟骨細(xì)胞饑餓24 h后，軟骨細(xì)胞胞體積變小，數(shù)量變少，部分軟骨細(xì)胞胞體回縮，并可見透亮、變圓，甚至壞死，見圖1。貼壁后的退變軟骨細(xì)胞饑餓24 h后，隨機(jī)分組，分別用珍骨膠囊含藥血清、生理鹽水空白血清干預(yù)，24 h后實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2組軟骨細(xì)胞數(shù)量均快速增加，但含藥血清組細(xì)胞個(gè)體較大，形態(tài)相似，數(shù)量明顯增多，排列較為整齊；48 h后，盡管2組軟骨細(xì)胞基本融合，但含藥血清組比空白血清組軟骨細(xì)胞快速增長聚集，形成細(xì)胞小結(jié)，細(xì)胞間邊界不清晰。72 h后2組均見有散在的細(xì)胞小結(jié)，但空白血清組軟骨細(xì)胞體較小，見圖2、圖3。

3.2不同濃度含藥血清對(duì)退變軟骨細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)含藥血清組其軟骨細(xì)胞增殖速度隨著含藥血清濃度增加而加快，當(dāng)含藥血清濃度達(dá)到20%時(shí)其增殖速度最快，與同一濃度空白血清組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。然而其增長速度沒有和血清濃度呈正比，隨著含藥血清濃度的增加，軟骨細(xì)胞的增殖速度并沒有一直增長，反倒有下降的趨勢(shì)，見表1。空白血清組軟骨細(xì)胞隨血清濃度增加增殖速度未見明顯改變，當(dāng)濃度為30%時(shí)，軟骨細(xì)胞增殖速度反而明顯降低。

表1　2組不同濃度血清對(duì)退變軟骨細(xì)胞增殖的影響對(duì)比（±s）%

表1　2組不同濃度血清對(duì)退變軟骨細(xì)胞增殖的影響對(duì)比（±s）%

注：與空白血清組比較，1）P＜0.05。

組別含藥血清組空白血清組30 0.517±0.021 0.549±0.017 10 0.552±0.019 0.539±0.023 15 0.583±0.013 0.554±0.012 20 0.634±0.0291）0.586±0.015

3.3含藥血清干預(yù)后對(duì)退變軟骨細(xì)胞周期分布的測(cè)定見表2。隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移以及血清干預(yù)，2組軟骨細(xì)胞周期分布發(fā)生變化，其G0/G1期細(xì)胞比例下降，而S期、G2/M期細(xì)胞比例上升，PI升高，以含藥血清組變化顯著。干預(yù)24、48、72 h，含藥血清組G0/G1期細(xì)胞比例明顯低于同期空白血清組，有顯著性差異（P＜0.05）。干預(yù)24、48、72 h，S期、G2/M期細(xì)胞比例及 PI均高于同期空白血清組，除干預(yù)72 h除G2/M期細(xì)胞比例外，其余差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

4　討論

4.1中藥具有簡、便、廉、驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎療效確切［2］。珍骨膠囊含藥血清促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的作用骨性關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)“痹證”范疇，內(nèi)因與肝、脾、腎相關(guān)，外因與風(fēng)、寒、濕、瘀血相關(guān)。中醫(yī)治療骨性關(guān)節(jié)炎多采用補(bǔ)肝腎健脾，祛風(fēng)散寒除濕，舒筋活血通絡(luò)。我院應(yīng)用珍骨膠囊60余載，對(duì)痹證日久，肝腎兩虛患者療效顯著。珍骨膠囊內(nèi)含淫羊藿、肉蓯蓉、紫河車、黨參、三七、兩面針6味中藥，淫羊藿溫腎壯陽，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕，為君藥；肉蓯蓉溫補(bǔ)腎陽，益精血；紫河車補(bǔ)氣，養(yǎng)血，益精，為臣藥；黨參補(bǔ)脾益肺；三七化瘀止血，活血定痛；佐以兩面針行氣止痛，通絡(luò)祛風(fēng)。諸藥合用，達(dá)到補(bǔ)腎養(yǎng)血、通絡(luò)祛風(fēng)的功效。

4.2研究表明軟骨細(xì)胞的增殖與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)密切相關(guān)，細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)可以影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。因此，通過調(diào)控細(xì)胞周期，可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖。同時(shí)細(xì)胞中的DNA含量與細(xì)胞周期密切相關(guān)，并隨著細(xì)胞周期變化而發(fā)生變化［4］。DNA分析反映著細(xì)胞生長增殖的具體過程，其中G0期細(xì)胞是尚未進(jìn)入增殖狀態(tài)的靜止期細(xì)胞，G1期為DNA合成前期，S期為DNA合成期，在S期結(jié)束后DNA由二倍體成為四倍體，進(jìn)入G2期，G2期主要為分裂期（M期）儲(chǔ)備能量。文獻(xiàn)顯示細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）是反映細(xì)胞增殖的重要指標(biāo)之一，顯示DNA合成速度和細(xì)胞增殖情況［5］。它是S期與G2/M期DNA含量之和與S期、G2/M及G0/G1期DNA含量總和的比值。本研究將珍骨膠囊含藥血清組與空白血清組對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，珍骨膠囊含藥血清能促進(jìn)軟骨細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，隨著干預(yù)時(shí)間的延長，G0、G1期細(xì)胞比例下降，S期、G2/M期細(xì)胞比例上升，PI升高。干預(yù)24、48、72 h后G0、G1期細(xì)胞比例降低，S期與G2/M期細(xì)胞之和增加。干預(yù)24、 48、72 h，S期、G2/M期細(xì)胞比例及PI均高于同期空白血清組，有顯著性差異（P＜0.05）。提示珍骨膠囊含藥血清可以促使更多體外培養(yǎng)退變軟骨細(xì)胞迅速進(jìn)入增殖周期，推進(jìn)退變軟骨細(xì)胞由G0/G1期向S期、G2/M期推進(jìn)，推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)程，促進(jìn)退變軟骨細(xì)胞增殖。將干預(yù)前的退變軟骨細(xì)胞饑餓24 h，使細(xì)胞周期同步為G0/G1期［6］，可見細(xì)胞體積回縮變小。用珍骨膠囊含藥血清后，細(xì)胞迅速增殖，胞體增大明顯，48 h后形成細(xì)胞小結(jié)。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)新西蘭大白兔含藥血清的觀察，發(fā)現(xiàn)珍骨膠囊含藥血清能有效促進(jìn)退變軟骨細(xì)胞的增殖。

表2　退變軟骨細(xì)胞周期分布（%）

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R285.5

A

1000-338X（2016）01-0030-03珍骨膠囊是我院院內(nèi)制劑，在治療骨關(guān)節(jié)炎臨床實(shí)踐中，療效顯著。本研究是在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)的研究方法，觀察含藥血清對(duì)退變軟骨細(xì)胞增殖的影響，旨在從細(xì)胞分子水平探討珍骨膠囊調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。

2015-11-17

福建省衛(wèi)生廳青年科研基金資助課題（2012-2-115）

黃慶生（1980—），男，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事四肢創(chuàng)傷及小兒骨科的臨床研究。