崔李群 方朝暉 羅 云

芪歸糖痛寧顆粒對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)糖基化終末產(chǎn)物、聚ADP核糖聚合酶基因表達(dá)的影響

崔李群1方朝暉2羅 云1

目的探討芪歸糖痛寧顆粒對糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN）的作用機(jī)制。方法SD大鼠65只，隨機(jī)留取10只為空白對照組，其余55只給予高脂飼料喂養(yǎng)4周后，空腹12h鏈脲佐菌素（STZ）60mg/kg一次性腹腔注射復(fù)制DPN大鼠模型，將42只成模大鼠分為模型組（M組）9只、芪歸糖痛寧顆粒高劑量組（QTG高組）、芪歸糖痛寧顆粒低劑量組（QTG低組）和甲鈷胺片組（J組）組各11只，分別予以相應(yīng)藥物灌胃，空白對照組（Con組）和模型組實(shí)驗(yàn)期間予以生理鹽水灌胃，療程12周，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分別對大鼠空腹血糖（FPG）、神經(jīng)傳導(dǎo)速度、血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、神經(jīng)生長因子（NGF）水平及坐骨神經(jīng)糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）、聚ADP核糖聚合酶（PARP）基因的表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果治療后，與模型組（M組）比較，芪歸糖痛寧顆粒高（QTG高組）、低劑量（QTG低組）組均能降低糖尿病大鼠血糖[（14.08±3.54）mmol/L、（16.11±2.95）mmol/L比（20.41±2.25）mmol/L，P＜0.01或P＜0.05）]，改善神經(jīng)傳導(dǎo)速度（49.16±5.37）m/s、（43.76± 3.93）m/s比（39.66±3.65）m/s，P＜0.01或P＜0.05）]，降低血清MDA水平（14.91±1.23）nmol/L、（15.22± 0.55）nmol/L比（16.75±1.67）nmol/L，P均＜0.05）]，降低坐骨神經(jīng)AGEs mRNA的表達(dá)（0.572± 0.021，0.983±0.013比1.088±0.032，P均＜0.01），降低PARP mRNA的表達(dá)（0.677±0.035、0.829± 0.015比1.113±0.024，P＜0.01）；與模型組（M組）比較，芪歸糖痛寧顆粒高劑量組升高血清SOD水平（112.87±4.98）U/mL比（97.55±4.93）U/mL，P＜0.01），升高血清NGF水平[（37.38±4.51）ng/L比（26.06±4.41）ng/L，P＜0.01）]。結(jié)論芪歸糖痛寧顆粒通過抑制氧化應(yīng)激與AGEs、PARP途徑的相互作用，從而防治和延緩大鼠糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生。

大鼠；糖尿病周圍神經(jīng)病變；芪歸糖痛寧顆粒；AGEs；PARP

糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）是糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）患者常見且致殘性較高的慢性并發(fā)癥之一。由于缺乏統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)和檢測方法，其患病率有較大差異，在10%～96%[1]。芪歸糖痛寧顆粒是在臨床經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上開發(fā)的中藥復(fù)合制劑，初步研究表明其對治療DPN安全有效[2]。本研究以鏈脲佐菌素誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性DPN大鼠模型，以神經(jīng)營養(yǎng)藥甲鈷胺作為對照，觀察芪歸糖痛寧顆粒對氧化應(yīng)激及糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycationend products，AGEs）、聚ADP核糖聚合酶（Poly ADP-Ribose Polymerase，PARP）基因表達(dá)的影響，為其臨床治療DPN提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物SD雄性大鼠65只，清潔級，體質(zhì)量180～220g，安徽省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK（皖）2011-002。

1.2 藥品與試劑芪歸糖痛寧顆粒（安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心，批號20110809）；甲鈷胺片[衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司，批號1309007]；鹽酸二甲雙胍片（上海施貴寶制藥有限公司，批號1208091）；大鼠血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）、AGEs、PARP試劑盒（南京建成科技有限公司）。

1.3 儀器血糖儀、試紙（美國強(qiáng)生公司）；普通PCR儀（杭州晶格科學(xué)儀器有限公司）；UV-754紫外分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）；紫外凝膠成像分析儀（北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司）；溫度梯度基因擴(kuò)增儀（德國MIONETRA）；ELX808及EKX-50酶標(biāo)儀、洗板機(jī)（美國BIO-TEK，EKX-50）；計(jì)算機(jī)MS2000多媒體化生物信號記錄分析系統(tǒng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型建立及分組65只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白對照組10只和造模組55只?？瞻讓φ战M喂養(yǎng)方式不變，其余大鼠進(jìn)行4周的高脂飼料喂養(yǎng)后，禁食12h予鏈脲佐菌素（STZ）60mg/kg一次性腹腔注射，誘發(fā)DPN大鼠模型[3]?？瞻讓φ战M注入等容量檸檬酸緩沖液。于72h后測尾靜脈采血隨機(jī)血糖，以血糖≥16.7mmol/L列入觀察對象。42只成模大鼠隨機(jī)分為模型組（M組）9只、芪歸糖痛寧顆粒高劑量組（QTG高組）、芪歸糖痛寧顆粒低劑量組（QTG低組）、甲鈷胺片組（J組）各11只。實(shí)驗(yàn)期間空白對照組（Con組）喂以基礎(chǔ)飼料至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，余四組均喂以高脂飼料。

2.2 給藥方法給藥劑量參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[4]，大鼠等效劑量相當(dāng)于人的6.3倍。根據(jù)每只大鼠體質(zhì)量不同，計(jì)算大鼠每日給予芪歸糖痛寧顆粒灌胃劑量，其中QTG高組為等效劑量的2倍[12g/（kg·d）]，QTG低組為等效劑量的0.5倍[3g/（kg·d）]。甲鈷胺片劑量參照文獻(xiàn)[5]按照0.3（mg/kg·d）給藥，根據(jù)大鼠體質(zhì)量計(jì)算每天灌胃量。以上各組，實(shí)驗(yàn)全程均以鹽酸二甲雙胍，使用劑量為臨床成人劑量10倍，用其混懸液灌胃，作為基礎(chǔ)降糖治療。Con組與M組實(shí)驗(yàn)期間予以生理鹽水5mL/（kg·d）灌胃。以上藥物混懸液均以蒸餾水配制，每2周稱體質(zhì)量調(diào)藥量。各組均每日灌胃1次，連續(xù)12周。

2.3 檢測指標(biāo)及方法

2.3.1 大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度測定用藥12周末，大鼠予以戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射進(jìn)行麻醉，在左坐骨切跡插入電極，在踝部（遠(yuǎn)端）和左足底第二趾間分別插入記錄電極并連接計(jì)算機(jī)MS2000多媒體化生物信號記錄分析系統(tǒng)，記錄遠(yuǎn)近端坐骨神經(jīng)產(chǎn)生動作電位的潛伏期，測定兩記錄電極間的距離，并計(jì)算MNCV（m/s）。MNCV=電極之間的距離/動作電位潛伏期，比較各組大鼠神經(jīng)傳導(dǎo)速度的變化。

2.3.2 大鼠血清SOD、MDA、NGF水平測定采用黃嘌呤氧化酶法檢測血清SOD水平，硫代巴比妥酸法檢測血清MDA水平，雙抗體夾心ELISA法測定大鼠血清NGF水平。試劑盒購自南京建成科技有限公司，具體方法嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

2.3.3 大鼠坐骨神經(jīng)AGEs、PARP mRNA表達(dá)的檢測取大鼠坐骨神經(jīng)，提取總RNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，qPCR擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參照。AGEs引物上游：5'-CAACCCAGACTCGAGGAGAG-3'，下游：5'-AGAAAGTGGCTCGAGGTTGA-3'，產(chǎn)物片段223bp；PARP引物上游：5'-CTGGAGTCCGACAAGGAGAG-3'，下游：5'-TCACCGCCAGCTTCTTTACT-3'，產(chǎn)物片段250 bp；GAPDH引物上游：5'-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3'，產(chǎn)物片段496bp。采用自動電泳凝膠成像分析儀分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件包，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s） 表示，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)可通過對數(shù)變換等使其接近正態(tài)分布；多個均數(shù)間比較采用方差分析，兩樣本比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)造模時，DM大鼠造模有13只未達(dá)到高血糖標(biāo)準(zhǔn)予以剔除；實(shí)驗(yàn)過程中，因大鼠血糖過高、灌胃過程中操作不當(dāng)、大鼠自身打斗等原因，J組死亡2只，Con組死亡1只；M組死亡1只；QTG高組死亡1只，QTG低組死亡1只。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，各組剩余大鼠數(shù)分別為Con組9只：M組8只、J組9只、QTG高組10只、QTG低組10只。

3.1 各組大鼠空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）比較治療前M組、QTG高、低組和J組大鼠FPG均高于Con組（P＜0.01）。治療后，M組、QTG高、低組和J組大鼠FPG均高于Con組（P＜0.01）。QTG高、低組和J組大鼠均低于M組（P＜0.01或P＜0.05），但此三組之間FPG比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠空腹血糖（FPG）比較（mmol/L，x±s）

3.2 各組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較治療后，M組、QTG高、低組和J組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度均低于Con組（P＜0.01）；QTG低組和J組大鼠均高于M組（P＜0.05），QTG高組與M組比較，升高明顯（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較（m/s，x±s）

3.3 各組大鼠血清SOD、MDA、NGF比較治療后，M組、QTG高、低組和J組大鼠血清SOD水平均低于Con組（P＜0.01）；與M組比較，QTG高組和J組大鼠血清SOD水平均有升高（P＜0.01或P＜0.05）；QTG高組與J組比較有所升高（P＜0.05）；QTG高組與QTG低組比較有所上升（P＜0.01）。J組與QTG低組比較有所升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，M組、QTG高、低組和J組大鼠血清MDA水平均高于Con組（P＜0.01）；QTG高、低組和J組大鼠血清MDA水平與M組比較均有下降（P＜0.05），但此三組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。M組、QTG低組和J組大鼠血清NGF水平均低于Con組（P＜0.01），QTG高組雖低于Con組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；QTG高組和J組大鼠血清NGF水平與M組比較均有升高（P＜0.01或P＜0.05）。QTG低組大鼠血清NGF水平與M組比較雖有升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、神經(jīng)生長因子（NGF）比較（x±s）

3.4 各組大鼠坐骨神經(jīng)AGEs、PARP mRNA表達(dá)比較QTG高、低組和J組大鼠AGEs、PARP mRNA表達(dá)均高于Con組，低于M組（P＜0.01）；大鼠AGEs mR-NA表達(dá)，QTG高組低于J組（P＜0.05），QTG低組高于J組（P＜0.01）。大鼠PARP mRNA表達(dá)，QTG高、低組均低于J組（P＜0.01）。見表4，圖1（插頁）。

表4 各組大鼠坐骨神經(jīng)糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）、聚ADP核糖聚合酶（PARP）基因表達(dá)比較（x±s）

4 討論

DPN發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。目前認(rèn)為氧化應(yīng)激效應(yīng)和氧自由基直接損傷在DPN發(fā)病過程中起著重要作用。MDA是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，其含量能夠體現(xiàn)組織細(xì)胞中氧自由基的含量；SOD通過一系列化學(xué)反應(yīng)緩沖及清除自由基而顯示出抗氧化損傷的作用，是機(jī)體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分。氧化應(yīng)激與糖基化終末產(chǎn)物AGEs形成途徑在DPN發(fā)病中相互促進(jìn)、相互影響。AGEs與糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）結(jié)合產(chǎn)生大量活性氧簇（reactive oxygen series，ROS），ROS使氧化還原敏感性轉(zhuǎn)錄因子活化和糖酵解過程中間產(chǎn)物增加，進(jìn)而促進(jìn)AGEs的生成。高血糖狀態(tài)時，AGEs生成明顯增加，AGEs結(jié)合一氧化氮（nitrogenoxide，NO）后可產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致神經(jīng)缺血改變。在外周神經(jīng)組織中，AGE的產(chǎn)生及AGE-RAGE系統(tǒng)的作用可進(jìn)一步刺激炎基因的轉(zhuǎn)錄和氧化應(yīng)激的發(fā)生，最終出現(xiàn)糖尿病外周神經(jīng)結(jié)構(gòu)異常和神經(jīng)功能的障礙[6]。研究[6]證明，AGEs可以引起微管蛋白和神經(jīng)絲的改變，從而影響軸突的運(yùn)輸，而軸突運(yùn)輸?shù)闹袛嗫纱偈股窠?jīng)纖維發(fā)生萎縮和退化。PARP途徑在DPN發(fā)生發(fā)展過程中也與氧化應(yīng)激有一定的聯(lián)合作用。高血糖時，游離基團(tuán)及氧化劑刺激了PARP活化，而被激活的PARP也會引起氧化應(yīng)激。最近的研究已表明，DM患者高血糖狀態(tài)可誘導(dǎo)周圍神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生氧化應(yīng)激效應(yīng)，激活PARP-1，影響細(xì)胞能量代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和神經(jīng)軸突轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞代謝障礙或死亡，是DPN的進(jìn)展的重要因素之一[7]。

DPN屬中醫(yī)“消渴”兼癥，是由消渴日久，內(nèi)熱傷陰耗氣，氣虛無力運(yùn)行血脈，陰虛脈絡(luò)不榮瘀滯，陰損及陽，陽虛寒凝，血液凝滯，脈絡(luò)瘀阻所導(dǎo)致。治療上常將益氣養(yǎng)陰與活血通絡(luò)相結(jié)合，標(biāo)本兼治。本研究所用益氣養(yǎng)陰通絡(luò)復(fù)方芪歸糖痛寧顆粒，主要由黃芪、當(dāng)歸、生地黃、延胡索、葛根、雞血藤、威靈仙等組成。以黃芪大補(bǔ)脾胃之氣，旨在令氣旺血行而瘀去絡(luò)通；當(dāng)歸藥性甘緩，補(bǔ)血行血，祛邪而不傷正，二者同用，共為君藥；葛根升陽、生津止渴，生地清熱涼血，養(yǎng)陰生津，助黃芪、當(dāng)歸益氣活血生津?yàn)槌妓帲浑u血藤活血補(bǔ)血，延胡索辛散活血、行氣、止痛共為佐藥。威靈仙祛風(fēng)通絡(luò)而止痛，使十二經(jīng)脈通行順暢，藥性直趨病所，為使藥。諸藥合用，氣血同治，標(biāo)本兼顧，具有益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)之功，防治和延緩DPN，改善DPN臨床癥狀，標(biāo)本同治，諸藥共濟(jì)[2]。

本研究結(jié)果顯示，干預(yù)12周后，芪歸糖痛寧顆粒能夠降低糖尿病大鼠血糖，改善神經(jīng)傳導(dǎo)速度，升高血清SOD、NGF水平，降低MDA水平，下調(diào)坐骨神經(jīng)AGEs、PARP mRNA表達(dá)水平，提示芪歸糖痛寧顆粒能夠綜合控制氧化應(yīng)激與AGEs生成途徑及PARP途徑的聯(lián)合作用對DPN的影響，保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)，從而有效防治DPN。

［1］管凌志.前列地爾聯(lián)合甲鈷胺治療糖尿病周圍神經(jīng)病變37例［J］.臨床醫(yī)學(xué)，2015，24（1）：76-78.

［2］方朝暉，趙進(jìn)東.芪歸糖痛寧顆粒治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的臨床觀察［J］.中醫(yī)藥臨床雜志，2012，24（2）：126-128.

［3］賁瑩，張風(fēng)華，梁文杰，等.不同黃芪劑量補(bǔ)陽還五湯對糖尿病大鼠神經(jīng)功能及氧化應(yīng)激的作用［J］.中成藥，2015，37（1）：199-201.

［4］魏偉，吳希美，李元建.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.第4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：212.

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（收稿：2016-07-11修回：2016-10-20）

Effect of Qigui Tangtongning Granules(QTG)on the Expression of Advanced Glycation End Products and Poly ADP-ribose Polymerase mRNA in Sciatic Nerve of Diabetic Rats

CUI Liqun1,FANG Zhaohui2,LUO Yun1.1 Department of Endocrinology,Chinese Medical Hospital of Yuhang,Hangzhou,Hangzhou(311106),China; 2 Department of Endocrinology,First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine,Hefei(230031), China

Objective To investigate the effect of Qigui Tangtongning Granules（QTG）on diabetic peripheral neuropathy（DPN）.Methods Sixty-five SD rats were used in this study.Fifty-five of those were fed with high fat diet for 4 weeks,then fasted for 12 h before intraperitoneal injection of 60 mg/kg STZ to induce the model of type 2 diabetis.Forty-two models were successfully established and random ly divided into model group（n=9）,highdose QTG group（n=11）,low-dose QTG group（n=11）,and mecobalamine group（n=11）.The corresponding drugs were administered by gavage.The rest 10 rats serviced as controls.Control group and model group were given citric acid buffer solution.The course of treatment was 12 weeks.At the end of the experiment,fasting plasma glucose was detected,the nerve conduction velocity was measured,serum superoxide dismutase（SOD）,malondialdehyde（MDA）and nerve growth factor（NGF）were determined,and the expression of advanced glycation end products（AGEs）and poly ADP-ribose polymerase（PARP）mRNA in sciatic nerve was assessed.Results Compared withmodel group,high-dose and low-dose QTG groups decreased levels of FPG（14.08±3.54mmol/L and 16.11±2.95mmol/ L vs 20.41±2.25mmol/L,P＜0.01 or P＜0.05）,improved the nerve conduction velocity in diabetic rats（49.16±5.37m/s and 43.76±3.93m/s vs 39.66±3.65m/s,P＜0.01 or P＜0.05）,reduced serum MDA（14.91±1.23nmol/L and 15.22±0.55nmol/L vs 16.75±1.67nmol/L,P＜0.05）,AGEs mRNA（0.572±0.021 and 0.983±0.013 vs 1.088±0.032；P＜0.01）,and PARP mRNA（0.677±0.035 and 0.829±0.015 vs 1.113±0.024,P＜0.01）,meanwhile high-dose QTG group increased serum SOD（112.87±4.98U/mL vs 97.55±4.93U/mL,P＜0.01）and serum NGF（37.38±4.51ng/L vs 26.06±4.41ng/L,P＜0.01）. Conclusion QTG can inhibit the interaction of oxidative stress and the pathway of AGEs and PARP to improve the structure and function injury of nerves,so as to prevent and treat diabetic peripheral neuropathy.

rats;diabetic peripheral neuropathy;Qigui Tangtongning Granule;AGEs;PARP

國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科——內(nèi)分泌學(xué)（No.20091221）

1杭州市余杭區(qū)中醫(yī)院內(nèi)分泌科（杭州311106）；2安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科（合肥230031）

崔李群，Tel：18157187919；E-mail：779557148@qq.com