粟 謀 貝朝涌* 蔣林彬 徐威, 陳寧

1.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院四肢創(chuàng)傷骨科 541001 2.桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院 541004

神經(jīng)生長因子(Nerve Growth Factor, NGF)在促進(jìn)骨折愈合修復(fù)中是重要生長因子之一[1]。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Stromal Cells, BMSCs)是目前已成為應(yīng)用較廣泛的骨組織工程重要種子細(xì)胞[2，3]?；蚪M織工程給我們提供了良好的方法，它利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)使得編碼特定功能因子的基因轉(zhuǎn)至種子細(xì)胞里或生物活性基質(zhì)材料，讓轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)目的基因及產(chǎn)物，在體內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化而發(fā)揮正常的生理功能。

本研究實(shí)驗(yàn)利用PCR方法擴(kuò)增hNGF基因cDNA，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3-hNGF并轉(zhuǎn)染至大鼠BMSCs中，檢測其表達(dá)活性。為骨折的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑及材料 hNGF基因片段、TIANGEN逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶HindⅢ、BamHI、pcDNA3質(zhì)粒載體、T4-DNA連接酶(NEB)、DH5α大腸桿菌(武漢淅瑪生物技術(shù)有限公司)，DMEM(Low Glu)細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone)、DNA marker(南寧天地?fù)P生物有限公司)，Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(invitrogen公司)，RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，ab52918NGF抗體(ABCAM公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。大鼠第5代BMSCs細(xì)胞由本課題組分離培養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1真核表達(dá)載體pcDNA3-hNGF的構(gòu)建及鑒定：① 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank公布的hNGF-cDNA。用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。交由武漢淅瑪生物技術(shù)有限公司合成。

上游引物: 5′-CCCAAGCTTGCCGCCACCA TGTCCATGTTGTTCTACACTCTGA -3′(含限制酶切位點(diǎn)HindⅢCCCAAGCTT)，

下游引物: 5′- CGCGGATCCTCAGGCTCTTCTC ACAGCCTTCCTGCTGA -3′(含限制酶切位點(diǎn)BamHI CGCGGATCC)。②目的基因的擴(kuò)增 將hNGF基因片段按如下PCR程序擴(kuò)增：預(yù)變性：94 ℃，3 min；變性：94 ℃，30 sec；退火：56 ℃，30 sec；延伸：72℃，1 min；共35個(gè)循環(huán)。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果，用DNA純化試劑盒純化提取hNGF目的基因的PCR產(chǎn)物。③真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-hNGF的構(gòu)建及鑒定 目的DNA片段和pcDNA3分別進(jìn)行HindⅢ和BamHI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測并線性化載體，用DNA純化試劑盒回收酶切DNA片段。酶切后的pcDNA3 線性質(zhì)粒和目的DNA 片段與T4DNA 連接酶建立連接反應(yīng)，16℃連接20 h至T載體上。取連接反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，接種在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)皿上，倒置培養(yǎng)12～16 h。根據(jù)藍(lán)白斑進(jìn)行篩選，取陽性克隆進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒HindⅢ和BamHI雙酶切鑒定，并送測序鑒定。

1.2.2重組質(zhì)粒pcDNA3-hNGF轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs及Western blot檢測：復(fù)蘇凍存于液氮中的第5代大鼠BMSCs，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基中，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入6孔板中，分為3組：A組為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組, B組為脂質(zhì)體包裹的空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，C組為脂質(zhì)體包裹hNGF的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。取純化的pcDNA3-hNGF及空載體pcDNA3各4 μg，按Lipofectamine2000說明書進(jìn)行操作，將各組載體轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs。收集轉(zhuǎn)染后72 h各組細(xì)胞，RIPA細(xì)胞裂解液裂解后，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。加入ab52918NGF抗體，使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵化，通過超敏ECL法檢測試劑盒檢測目的蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1擴(kuò)增的hNGF基因

PCR擴(kuò)增hNGF基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見擴(kuò)增得到約720 bp的片段。DNA序列測定表明擴(kuò)增片段的核苷酸序列與GenBank上的hNGF編碼區(qū)基因完全一致(圖1)。

圖1 hNGF cDNA擴(kuò)增后瓊脂糖電泳結(jié)果DL1000 Marker(Left to right)：100bp、250bp、500bp、750bp、1000bpFig.1 Results of hNGF cDNA amplification agarose gel electrophoresis

2.2基因重組質(zhì)粒pcDNA3-NGF的鑒定

2.2.1雙酶切驗(yàn)證

使用HindⅢ、BamHI對2份重組質(zhì)粒pcDNA3-hNGF進(jìn)行雙酶切電泳鑒定。產(chǎn)生和hNGF cDNA大小一致的片段(圖2)。

圖2 pcDNA3-NGF雙酶切電泳結(jié)果DL2000 Marker(從左往右)：100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp1，2泳道：雙酶切后pcDNA3-hNGF 3泳道：DL2000 MarkerFig.2 Results of pcDNA3-NGF double digestion electrophoresis.DL2000 Marker(Left to right)：100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bpLanes 1,2: pcDNA3-hNGF after double digested.Lane 3: DL2000 Marker

2.2.2測序鑒定結(jié)果:將NGF基因經(jīng)HindⅢ、BamHI雙酶切反應(yīng)載體和pcDNA3 連接后，成功構(gòu)建pcDNA3-hNGF，重組質(zhì)粒送武漢淅瑪生物技術(shù)有限公司進(jìn)行基因測序與對比分析，測序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pcDNA3-hNGF插入的序列與GenBank 中hNGF上的序列完全一致。

2.3Western blot檢測pcDNA3-hNGF在BMSCs中的表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染后72 h各組細(xì)胞行Western blot 檢測hNGF表達(dá)情況。Western blot 檢測到hNGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組有明顯的陽性條帶，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組的條帶較弱(圖3)。

圖3 Western blot 檢測hNGF蛋白表達(dá)Fig.3 Western blotting protein detection of hNGF expressionA: liposomal transfection group; B: empty plasmid transfection group; C: hNGF plasmid group

3 討論

有研究表明NGF對骨折愈合修復(fù)有明顯影響[4,5]。NGF對骨組織的愈合作用在各方面、各層次相互交叉。它促進(jìn)骨折處的血液供應(yīng), 對骨折過程中的各種炎性細(xì)胞的調(diào)節(jié)；促進(jìn)肽能神經(jīng)纖維長入骨組織；增加骨折處的鈣沉積，促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨增加成骨細(xì)胞活性；直接或間接地促進(jìn)骨母細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞或骨細(xì)胞, 刺激骨細(xì)胞增殖分化，從而加速骨折愈合[6-8]。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建pcDNA3-hNGF表達(dá)質(zhì)粒，利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，使hNGF基因轉(zhuǎn)染至BMSCs，并在BMSCs表達(dá)hNGF目的基因蛋白。通過該生長因子在骨折局部的持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，在體內(nèi)促進(jìn)軟骨細(xì)胞或骨細(xì)胞增殖、分化，從而達(dá)到促進(jìn)骨折愈合的作用。

基因治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一是如何有效地將目的基因?qū)氚屑?xì)胞內(nèi)并使其穩(wěn)定表達(dá)。目前研究有病毒法和非病毒法[9,10]。兩者各有利弊。脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染是常用的非病毒轉(zhuǎn)染法之一，其不存在病毒的污染，相對安全。但是，脂質(zhì)體具有一定的細(xì)胞毒性，尤其是高濃度的脂質(zhì)體可以使細(xì)胞裂解；并且不同的細(xì)胞系對不同的脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染的反應(yīng)有差異，因此研究者必須在每個(gè)細(xì)胞系中采用最優(yōu)化的轉(zhuǎn)染比例[11,12]。脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的效率與細(xì)胞接種密度、生長狀態(tài)、DNA和脂質(zhì)體劑量、轉(zhuǎn)染時(shí)間等多種因素有關(guān)，其中DNA與脂質(zhì)體的比例最為重要。在實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)DNA的劑量1 μg時(shí)，脂質(zhì)體劑量超過1 μL以后，脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性就非常明顯，轉(zhuǎn)染后的BMSCs的生長和分化受到極大影響。因此，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Lipoefctmaine試劑盒推薦的最佳細(xì)胞密度(2×105/2ml/孔)、生長狀態(tài)(70%-80%融合)，通過確定的DNA和脂質(zhì)體劑量(1 μg∶3 μL)，達(dá)到了較高的轉(zhuǎn)染效率和促BMSCs增殖和定向分化作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)利用PCR方法擴(kuò)增hNGF基因片段， 將hNGF基因片斷與T載體連接，構(gòu)建T-hNGF質(zhì)粒載體后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α篩選陽性克隆, 分別用HindⅢ和BamHI雙酶切T-hNGF質(zhì)粒和pcDNA3真核表達(dá)載體, 將克隆載體中hNGF基因重組到pcDNA3真核表達(dá)載體作酶切電泳、DNA 測序鑒定，測序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pcDNA3-hNGF插入的序列與GenBank 中hNGF上的序列完全一致。pcDNA3-hNGF轉(zhuǎn)染至大鼠BMSCs后，經(jīng)Western blot 檢測，證明重組質(zhì)粒pcDNA3-hNGF轉(zhuǎn)染BMSCs后能在大鼠BMSCs過表達(dá)hNGF蛋白。

因此，本研究成功構(gòu)建了pcDNA3-hNGF真核表達(dá)質(zhì)粒，從而為應(yīng)用神經(jīng)生長因子修飾的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行骨折治療研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。