祁珊珊 王永吉

陜西理工學院維生素D生理與應用研究所，陜西 漢中 723000

婦女絕經(jīng)后因卵巢功能下降、雌激素水平驟降，體內(nèi)骨轉換率顯著加快，骨吸收的速度超過骨形成的速度，導致骨量丟失、骨密度下降、骨骼脆性增加引起的骨質疏松癥稱為絕經(jīng)后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)[1]。去卵巢大鼠構建的骨質疏松模型是研究雌激素缺失引起的絕經(jīng)后骨質疏松癥的最適模型，該模型已廣泛應用于雌激素缺失誘導的骨質疏松癥的研究中[2]。我們前期在對去卵巢骨質疏松大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠卵巢去除后不僅會引起骨質丟失，還會引起子宮萎縮及子宮組織結構的改變[3]，我們推測子宮形態(tài)的改變可能是由于雌激素缺失所致，給藥補充外源雌激素是否會使子宮復原？本研究將用組織形態(tài)計量學方法對這一問題進行回答。

此外，肥大細胞是天然免疫的效應細胞之一，在天然免疫中發(fā)揮重要作用，是機體抗感染免疫的一線細胞，它能分泌40 余種生物活性物質或細胞因子(如組胺、蛋白酶、血管內(nèi)皮生長因子等)[4]。研究表明子宮肥大細胞數(shù)量在發(fā)情周期中發(fā)生波動，這種波動可能與雌激素的分泌活動有關?，F(xiàn)已證實人、倉鼠、小鼠、山羊子宮MC的數(shù)量分布隨動情周期的改變而呈周期性變化[5,6]，而雌激素也隨生殖周期的改變而改變。這提示了雌激素水平的改變可能是導致子宮中肥大細胞數(shù)量改變的直接原因。然而這些研究僅集中于動情周期，卵巢是機體產(chǎn)生雌激素的重要器官，卵巢切除后大鼠子宮肥大細胞是否會受影響，補充外源雌激素是否會對子宮肥大細胞產(chǎn)生影響？這方面的研究目前還沒有相關的文獻報道，本研究將利用組織學和組織化學的方法對上述問題進行回答。肥大細胞在數(shù)量與分布上的變化可能與子宮局部的免疫調(diào)節(jié)功能有關。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

40只3月齡健康雌性SD大鼠(由西安交通大學實驗動物中心提供，為國家A級實驗動物，許可證號：SCXK2012-003)，體質量194～230 g，分籠飼養(yǎng)，自由飲水，適應性飼養(yǎng)1 w后隨機分為手術組(OVX組)和假手術組(Sham組)，每組各半。

1.2 卵巢去除手術

手術方法見參考文獻[7]。

1.3 給藥及分組

大鼠卵巢去除手術后3個月，將卵巢摘除組(OVX)和假手術組(Sham)大鼠重新分組，分別是OVX組、OVX+苯甲酸雌二醇組、Sham組，每組6只，OVX+苯甲酸雌二醇組腹腔注射苯甲酸雌二醇20 μg/(kg·d)，每隔1天給藥1次，連續(xù)給藥28 d，Sham組和OVX組腹腔注射花生油作對照。具體分組及給藥方法見表1。

1.4 組織樣品采集

給藥28 d后，稱取大鼠體重，CO2麻醉后進行眼眶靜脈采血，采血結束頸椎脫臼處死大鼠。打開腹腔，取出子宮固定于3.7%多聚甲醛溶液中，4℃固定24 h。

1.5 子宮組織學及肥大細胞形態(tài)觀察

子宮組織樣品進行固定、脫水、石蠟包埋、切片(5 μm)，分別進行HE染色和改良甲苯胺藍染色，95%酒精分化，脫水，透明，封片，光學顯微鏡觀察子宮組織形態(tài)和子宮肥大細胞的分布。

1.6 肥大細胞的計數(shù)

每個子宮樣本每隔 5張連續(xù)切片計數(shù)一張，共查 5張， 每張切片為一完整的子宮橫斷面，低倍鏡下(10×10)計數(shù)子宮橫斷面所有肥大細胞，并求 5張切片肥大細胞的均數(shù)，據(jù)此求得各組肥大細胞計數(shù)值。

1.7 統(tǒng)計學處理

利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素組間方差分析和比較，結果以“平均值±標準差”表示，P<0.05時差異有統(tǒng)計學意義。

表1 各組動物的處理Table 1 Treatment of animals in each group

2 結果

2.1 苯甲酸雌二醇對去卵巢骨質疏松模型大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)的影響

組織學觀察顯示假手術組(Sham組)大鼠子宮壁結構正常，上皮為單層柱狀上皮，固有層分布有子宮腺，肌層為多層平滑肌，肌纖維排列緊密。去卵巢模型組(OVX組)大鼠子宮腔徑顯著變小，子宮黏膜上皮厚度較假手術組明顯減小，子宮內(nèi)膜和肌層明顯變薄，固有層子宮腺減少，腺腔狹窄，肌纖維細小。OVX大鼠給藥苯甲酸雌二醇28d后，子宮腔徑增大，黏膜上皮的厚度也明顯增大，組織形態(tài)計量數(shù)據(jù)見表2。

表2 大鼠子宮腔徑、肌層厚度、子宮黏膜上皮厚度的形態(tài)計量結果Table 2 The histomorphometry results of uterine cavity diameter, uterine muscle thickness, and uterine epithelium thickness in rats

2.2 子宮肥大細胞的分布及形態(tài)

圖1 肥大細胞在大鼠子宮中的分布及形態(tài)A. 子宮黏膜下層的肥大細胞 甲苯胺藍 200×；B.子宮黏膜下層血管旁的肥大細胞 甲苯胺藍 200×； C. 子宮腺體旁的肥大細胞 甲苯胺藍 400×； D. 子宮黏膜肌層的肥大細胞 甲苯胺藍400×；V. 血管；G. 腺體；箭頭所示為肥大細胞Fig.1 Distribution and morphology of mast cells in the rat uterusA. Mast cell in the submucosal of uterus, Toluidine blue staining, 200×; B. Mast cell around the lower blood vessels in the submucosal layer of uterus, Toluidine blue staining, 200×; C. Mast cells next to the gland of uterus, Toluidine blue staining, 400×; D. Mast cell in the mucous membrane of uterus, Toluidine blue staining, 400×; V. Blood vessel; G. Gland; The arrow points to the mast cells

大鼠子宮肥大細胞的分布基本一致，肥大細胞呈圓形、橢圓形或梭形，胞漿內(nèi)充滿紫紅色的異染性顆粒，并存在脫顆?，F(xiàn)象，單個散在分布于子宮中，主要分布在子宮肌層，子宮黏膜肌層平滑肌束間結締組織近小血管壁以及微血管附近居多，子宮腺周圍也有分布，子宮內(nèi)膜上皮中未發(fā)現(xiàn)(圖2)。

2.3 苯甲酸雌二醇對去卵巢骨質疏松模型大鼠子宮肥大細胞數(shù)量的影響

苯甲酸雌二醇對去卵巢骨質疏松模型大鼠子宮肥大細胞數(shù)量的影響(表3)。

表3 各組大鼠子宮橫斷面全層肥大細胞數(shù)量比較Table 3 The number of mast cells in the rat uterus

如表3所示，大鼠卵巢摘除后，子宮肥大細胞的數(shù)量較Sham組明顯增多，且差異極顯著(P<0.01)；給藥苯甲酸雌二醇后，子宮肥大細胞的數(shù)量與Sham組相比差異不顯著(P>0.05)，與OVX組相比，雌二醇給藥后肥大細胞數(shù)量較OVX組顯著減少。上述變化表明，隨著大鼠體內(nèi)雌激素水平的降低，子宮肥大細胞數(shù)量呈遞增趨勢。

3 討論

3.1 苯甲酸雌二醇對卵巢摘除大鼠子宮形態(tài)的影響

哺乳動物的子宮是卵巢雌激素的靶器官，卵巢雌激素對于維持子宮內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要的意義。我們前期的的實驗結果也表明，卵巢去除手術后3個月，與Sham組相比，OVX組大鼠子宮腔徑顯著變小，子宮肌層和黏膜上皮均明顯變薄，固有層子宮腺減少[3]。子宮的上述組織形態(tài)學變化證實雌性動物子宮黏膜的形態(tài)受卵巢雌激素的直接調(diào)節(jié)。這與人類的研究結果一致[8]。本研究結果顯示給藥苯甲酸雌二醇28 d后大鼠子宮形態(tài)恢復正常，子宮黏膜厚度、子宮腔徑、子宮黏膜上皮厚度等均較OVX組顯著增加，證實雌激素是子宮生理的主要調(diào)節(jié)劑。

3.2 苯甲酸雌二醇對卵巢摘除大鼠子宮內(nèi)MC數(shù)量的影響

Paul Ehrlich在1878年首次發(fā)現(xiàn)肥大細胞(mast cells，MC)，認為其在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮多種作用。肥大細胞在非特異性免疫中是重要的黏膜免疫相關細胞，其能夠分泌細胞因子從而參與獲得性免疫[9]。正常情況下，肥大細胞分布于機體結締組織、消化道和呼吸道黏膜、子宮內(nèi)膜、以及血管、淋巴管周圍，肥大細胞的這種分布可使其分泌的細胞因子能被血管內(nèi)皮細胞、呼吸道、胃腸道、子宮平滑肌細胞所利用[10]。研究表明哺乳動物(包括嚙齒類動物)子宮肥大細胞數(shù)量在發(fā)情周期中會發(fā)生波動，推測可能與雌激素以及孕酮的分泌活動有關，許多研究證實倉鼠、小鼠子宮內(nèi)肥大細胞數(shù)量在發(fā)情周期中發(fā)生波動[5,6]，但是這些研究僅集中于發(fā)情周期，沒有涉及去卵巢。本研究運用去除大鼠雙側卵巢阻斷雌激素的主要來源，發(fā)現(xiàn)去卵巢大鼠由于體內(nèi)雌激素水平的驟降導致子宮肥大細胞數(shù)量較Sham組大鼠急劇增加，給予去卵巢大鼠苯甲酸雌二醇28 d后，其子宮肥大細胞的數(shù)量又趨于正常，研究數(shù)據(jù)顯示雌激素水平的變化是導致子宮肥大細胞數(shù)量發(fā)生波動的重要原因。

近年來，有關激素和肥大細胞介導的免疫系統(tǒng)之間的相互作用、相互調(diào)節(jié)機制的研究很多[11-13]。研究顯示子宮中肥大細胞的數(shù)量是衡量子宮局部細胞免疫水平的指標，較外周血T細胞數(shù)量指標更精確，可直接反映子宮局部細胞免疫水平的變化[9]。本文研究發(fā)現(xiàn)大鼠卵巢去除后，大鼠子宮內(nèi)MC的數(shù)量增多，注射外源苯甲酸雌二醇后子宮肥大細胞數(shù)量減少，提示雌二醇對子宮MC數(shù)量有直接的影響，子宮可能通過改變MC的數(shù)量調(diào)節(jié)子宮局部免疫狀態(tài)。卵巢摘除后雌激素水平顯著降低，子宮可能通過增加肥大細胞的數(shù)量調(diào)節(jié)局部免疫功能，使機體處于恒定的狀態(tài)。Narita等[14]的研究認為，雌激素可使肥大脫顆粒，甚至細胞崩解，高濃度雌激素使肥大脫顆粒， 導致其數(shù)量減少， 這與本試驗結果相一致。子宮內(nèi)MC數(shù)量呈動態(tài)變化的特性，原因在于其所處器官局部微環(huán)境的不恒定性，即激素水平的不斷變化，這可能是子宮為適應生理功能的變化而通過肥大細胞對局部免疫的一種調(diào)節(jié)方式。本研究還表明，肥大細胞在正常子宮肌層中的數(shù)量明顯多于子宮內(nèi)膜，證實子宮肌層中肥大細胞參與正常子宮平滑肌的收縮。