孫平 胡伶平 董群偉 蔡妹群 王曉東 郭姣 劉忠厚

1. 廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨質(zhì)疏松基地，廣東 廣州 510006 2. 廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨科, 廣東 廣州 510006 3. 國(guó)家中醫(yī)藥管理局高脂血癥調(diào)肝降脂重點(diǎn)研究室, 廣東藥學(xué)院國(guó)家中醫(yī)藥管理局脂代謝三級(jí)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510006 4. 中國(guó)老年學(xué)學(xué)會(huì)骨質(zhì)疏松委員會(huì), 北京 100102

糖皮質(zhì)激素因具有強(qiáng)大的抗炎、抗免疫和抗休克作用，被廣泛應(yīng)用于器官移植、自身免疫疾病、炎癥及腫瘤治療等領(lǐng)域。但其導(dǎo)致的主要副作用之一——糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(glucocorticoid-induced osteoporosis, GIOP)，已成為普遍存在的臨床問(wèn)題，GIOP是醫(yī)源性骨質(zhì)疏松的最常見(jiàn)原因，其發(fā)生率僅次于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥及老年性骨質(zhì)疏松癥而位居第3位[1]。有報(bào)道指出，糖皮質(zhì)激素首先是引起脂質(zhì)代謝紊亂，其次引起骨量減少，如近年來(lái)發(fā)現(xiàn)他汀類(lèi)藥物在抗骨質(zhì)疏松的治療中起到積極作用[2,3]，但對(duì)肝臟、腎臟等副作用較明顯。基于此，本研究選用我校自主創(chuàng)新研發(fā)的具有護(hù)肝調(diào)脂作用的復(fù)方貞術(shù)調(diào)脂膠囊(FTZ)，通過(guò)改善脂代謝紊亂，以期對(duì)GIOP的防治起到有益作用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)分組

3月齡SPF級(jí)雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量(210±15)g，購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。適應(yīng)喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)平均分為4組：Nrm組為正常對(duì)照組，Met組為皮下注射甲強(qiáng)龍(Met)5 mg/(kg·d)，每周5次[4]，低劑量組(FTZL)和高劑量組(FTZH) 分別在Met組基礎(chǔ)上每天給予FTZ 1.5 g/kg和FTZ 6g/kg灌胃[5]，4組大鼠均單籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲用純凈水，實(shí)驗(yàn)期12w。實(shí)驗(yàn)期滿后用3.3%濃度的水合氯醛溶液(10mL/kg)麻醉，左心室放血處死大鼠。雙側(cè)股骨及第4，5腰椎(L4, L5)，剔除附著的軟組織，用浸濕生理鹽水的紗布包裹，置于置于-20 ℃的冰箱內(nèi)保存?zhèn)涔巧锪W(xué)和骨密度測(cè)定(1w內(nèi)測(cè)定)。

1.2 生物力學(xué)測(cè)定

1.2.1三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)：將剔除軟組織的右側(cè)股骨，置于生物力學(xué)試驗(yàn)機(jī)(MTS-858型, 美國(guó))上，支點(diǎn)跨距17 mm，加壓點(diǎn)為中點(diǎn)，加載速度2 mm/min，加載至骨折，計(jì)算機(jī)記錄載荷-位移曲線，根據(jù)載荷-位移曲線計(jì)算最大載荷、剛度和彈性模量。股骨中點(diǎn)所在截面近似地認(rèn)為呈橢圓形，數(shù)字游標(biāo)卡尺(精密度0.02 mm)測(cè)量其內(nèi)、外徑，計(jì)算骨宏觀幾何參數(shù)。

1.2.2壓縮試驗(yàn)：去除L4椎弓及附件單留椎體，砂紙打磨椎體上下表面，使之成為相互平行的平面，數(shù)字游標(biāo)卡尺(精密度0.02mm)測(cè)量椎體高度，根據(jù)阿基米德定律計(jì)算椎體橫斷面的面積。將標(biāo)本置于生物力學(xué)試驗(yàn)機(jī)(同上)上，下表面緊貼于不銹鋼板上，加載的方向與不銹鋼的表面垂直，行壓縮試驗(yàn)，加速度為2 mm/min，計(jì)算機(jī)記錄載荷-位移曲線。根據(jù)載荷-變形曲線計(jì)算椎體的最大載荷和剛度。

1.3 股骨和L5骨密度測(cè)定

將左側(cè)股骨及L5置于QDR4500A型雙能X線骨密度測(cè)定儀上，計(jì)算機(jī)采用小動(dòng)物梯級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分析軟件，自動(dòng)記錄股骨和L5骨密度。掃描速度10 mm/s，掃描間距0.5 mm× 0.5 mm。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 FTZ對(duì)大鼠骨生物力學(xué)參數(shù)的作用

實(shí)驗(yàn)期滿后，Met組大鼠L4和股骨的最大載荷、剛度、彈性模量顯著低于Nrm組相應(yīng)指標(biāo)(P<0.001,P<0.01)；FTZL組大鼠最大載荷、剛度、彈性模量較Met組有升高趨勢(shì)，但兩組間各指標(biāo)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；FTZH組大鼠L4和股骨的最大載荷、剛度、彈性模量顯著高于Met組相應(yīng)指標(biāo)(P<0.01,P<0.05)，且L4的最大載荷FTZH組顯著高于FTZL組(P<0.05)，L4的剛度、彈性模量和股骨的最大載荷、剛度、彈性模量FTZH組較FTZL組有增加趨勢(shì)，但兩組間各指標(biāo)均無(wú)顯著性差異(P>0.05) (見(jiàn)表1, 2)。

表1 各組大鼠股骨(右)三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)的結(jié)果Table 1 Tri-point bending parameters of the rat femur (right) in different

注：*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001, vs Nrm；#P< 0.05,##P< 0.01,###P< 0.001 vs Met；▲P< 0.05 vs FTZL

表2 各組大鼠L4壓縮試驗(yàn)幾何及力學(xué)參數(shù)的結(jié)果Table 2 Compression and geometrical parameters of

注：*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001 vs Nrm；#P< 0.05,##P< 0.01,###P< 0.001 vs Met；▲P< 0.05 vs FTZL.

2.2 FTZ對(duì)大鼠股骨和腰椎中段截面幾何參數(shù)的變化

Met組大鼠椎體橫斷面面積、股骨中段截面面積和皮質(zhì)骨厚度顯著低于Nrm組(P<0.001,P<0.01)，股骨骨髓腔面積顯著高于Nrm組(P<0.01)；FTZL組大鼠椎體橫斷面面積、股骨中段截面面積和皮質(zhì)骨厚度高于Met組，股骨骨髓腔面積低于Met組，但各指標(biāo)間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；FTZH組大鼠椎體橫斷面面積和皮質(zhì)骨厚度顯著高于Met組(P<0.05)，股骨髓腔面積顯著低于Met組(P<0.05)，股骨中段截面面積較Met組有增加趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)， FTZH組椎體橫斷面面積、股骨中段截面面積和皮質(zhì)骨厚度較FTZL組有增加趨勢(shì)，股骨骨髓腔面積低于FTZL組，但各指標(biāo)間均無(wú)顯著性差異(P>0.05) (見(jiàn)表2, 3)。

表3 各組大鼠股骨中段截面幾何參數(shù)的結(jié)果Table 3 Geometrical parameters of the middle femur section

注：*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001, vs Nrm；#P< 0.05,##P< 0.01,###P< 0.001 vs Met；▲P< 0.05 vs FTZL

2.3 藥物對(duì)大鼠左側(cè)股骨和L5骨密度的作用

4組大鼠間左側(cè)股骨和L5的骨密度均有差異(P<0.001,P<0.01,P<0.05)，Met組顯著低于Nrm組(P<0.001)；FTZH組股骨和L5骨密度均高于Met組(P<0.01,P<0.05)；FTZL組L5骨密度顯著高于Met組(P<0.05)，F(xiàn)TZH組L5骨密度顯著高于FTZL組(P<0.05) (表4)。

表4 各組大鼠骨密度結(jié)果Table 4 Results of BMD in different groups

注：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001, vs Nrm；#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001 vs Met；▲P<0.05 vs FTZL

3 討論

上世紀(jì)五十年代開(kāi)始將糖皮質(zhì)激素作為抗炎和免疫抑制藥物廣泛應(yīng)用于慢性阻塞性肺病、哮喘、風(fēng)濕免疫性疾病、炎性腸病等多種疾患及器官移植后的治療中。長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂、骨質(zhì)疏松癥及骨折危險(xiǎn)性增加等一系列副作用，成為其臨床應(yīng)用的主要障礙。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在接受糖皮質(zhì)激素治療的慢性疾病人群中，最終有30%～50%發(fā)展為骨質(zhì)疏松[6]，有超過(guò)1/3的絕經(jīng)后婦女長(zhǎng)期(> 6個(gè)月)口服糖皮質(zhì)激素治療，椎體至少發(fā)生過(guò)1次椎體骨折[7]，且絕經(jīng)后婦女長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素的患者往往同時(shí)伴有骨質(zhì)疏松和脂質(zhì)代謝紊亂[8,9]，有學(xué)者調(diào)查發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后婦女的血漿LDL-C與股骨頸及全髖BMD呈顯著負(fù)相關(guān)[10]，TC和LDL與股骨頸和腰椎BMD呈顯著負(fù)相關(guān)[11]。高脂血癥與骨質(zhì)疏松兩者在發(fā)病機(jī)制及臨床治療方面的關(guān)系已引起人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。在調(diào)脂治療中，骨質(zhì)疏松常常會(huì)改善，而在抗骨質(zhì)疏松治療的過(guò)程中，脂代謝紊亂也往往會(huì)得以逆轉(zhuǎn)，因此高脂血癥與骨質(zhì)疏松癥兩者在發(fā)病機(jī)制及臨床治療方面的相互關(guān)系已引起人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。

對(duì)于GIOP的治療目前仍沒(méi)有理想方法，原因是由此引起的骨質(zhì)疏松機(jī)制復(fù)雜。中藥尤其是中藥復(fù)方具有多環(huán)節(jié)，多靶點(diǎn)，多效應(yīng)器官發(fā)揮功效的特點(diǎn)，其在防治脂質(zhì)代謝紊亂及骨質(zhì)疏松方面，有著較大的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。我校郭姣教授自主研發(fā)的FTZ主要以佛手、黃連、杜仲、白術(shù)、丹參等為主要成分，具有調(diào)脂、抑斑塊、保護(hù)內(nèi)皮等一系列作用。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TZ能有效調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化家兔的脂代謝異常，對(duì)高脂血癥相關(guān)的HMG-CoA還原酶(HMGR)，肝臟X受體(LXR)，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)等均有潛在作用[5,12,13]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)該藥物能夠顯著增加大鼠皮質(zhì)骨厚度和骨小梁數(shù)目。因此本研究以調(diào)脂為基點(diǎn)，分別采用高、低劑量的FTZ以期觀察其對(duì)GIOP大鼠的骨量和骨質(zhì)量的積極作用。

BMD是診斷骨質(zhì)疏松癥的“金標(biāo)準(zhǔn)”，可以間接評(píng)價(jià)骨質(zhì)健康情況及骨強(qiáng)度，能夠較好地預(yù)測(cè)骨折的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。DXA在評(píng)價(jià)大鼠骨質(zhì)疏松模型及療效的判定方面有很好的精確性和準(zhǔn)確性，是一快速、可靠的技術(shù)手段。本研究發(fā)現(xiàn)，GIOP大鼠股骨和腰椎的BMD較正常組均顯著下降，與以往報(bào)道一致[4]，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)采用甲強(qiáng)龍致大鼠骨質(zhì)疏松模型建立成功。同時(shí)FTZH組能夠顯著增加GIOP大鼠股骨和腰椎的BMD，F(xiàn)TZL組僅能夠顯著增加腰椎BMD，且FTZH組顯著高于FTZL組，提示FTZ能夠有效延緩糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的大鼠骨量丟失特別是松質(zhì)骨，且呈劑量依賴(lài)性。骨生物力學(xué)是全面評(píng)價(jià)骨質(zhì)量最可靠的指標(biāo)，是骨量、骨結(jié)構(gòu)和骨強(qiáng)度的綜合體現(xiàn)，在評(píng)價(jià)治療骨質(zhì)疏松藥物對(duì)骨質(zhì)量影響中的作用無(wú)法被其他測(cè)定方式所取代。其中三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)主要反映皮質(zhì)骨的力學(xué)特性，壓縮實(shí)驗(yàn)主要是松質(zhì)骨力學(xué)特性的體現(xiàn)。我們發(fā)現(xiàn)，GIOP大鼠股骨和腰椎的結(jié)構(gòu)力學(xué)特性(最大載荷)、材料力學(xué)特性(剛度和彈性模量)均較正常組顯著降低，與其BMD的下降相一致，通過(guò)給予FTZH可顯著增加大鼠股骨和腰椎的結(jié)構(gòu)力學(xué)特性，在股骨三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)中，高、低劑量的FTZ兩組間未見(jiàn)顯著性差異；而在腰椎壓縮實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)TZH組的最大載荷顯著優(yōu)于FTZL組，表明高劑量的FTZ對(duì)提高骨生物力學(xué)特性方面有積極作用，且呈劑量依賴(lài)性，特別是對(duì)松質(zhì)骨力學(xué)特性的改善作用與BMD結(jié)果相符。骨橫截面積是反映骨膜骨形成的一項(xiàng)可靠指標(biāo)，本研究對(duì)股骨和腰椎宏觀幾何結(jié)構(gòu)的測(cè)量數(shù)據(jù)表明，GIOP大鼠股骨和腰椎宏觀幾何結(jié)構(gòu)的生物力學(xué)應(yīng)答調(diào)節(jié)機(jī)能減弱或消失，導(dǎo)致股骨中段截面面積和椎體橫截面積顯著性降低，股骨骨髓腔面積顯著增加，骨皮質(zhì)厚度減少，說(shuō)明大鼠骨膜骨形成受抑制，進(jìn)而影響到大鼠股骨及椎體的生物力學(xué)特性，與既往研究一致[14]。通過(guò)給予高劑量FTZ干預(yù)后可顯著增加大鼠股骨和腰椎的結(jié)構(gòu)力學(xué)和材料力學(xué)特性，改善骨宏觀幾何參數(shù)，對(duì)GIOP大鼠骨膜骨形成起到積極作用，在提高骨生物力學(xué)特性，增加骨質(zhì)量，降低骨折發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)方面效果明顯。

本研究結(jié)果初步表明，具有護(hù)肝調(diào)脂作用的FTZ可以延緩GIOP大鼠的骨量丟失，增加BMD，維持骨生物力學(xué)特性，提示FTZ在改善骨質(zhì)量、降低骨折的發(fā)生方面有一定的積極作用。本研究只是初步觀察FTZ對(duì)骨質(zhì)疏松癥的防治作用同時(shí)給我們提供了新的思路和方法，從改善脂質(zhì)代謝紊亂為出發(fā)點(diǎn)或許是抗骨質(zhì)疏松癥治療的另一途徑，后續(xù)FTZ對(duì)骨代謝的影響及其機(jī)制方面的探討目前正在進(jìn)行中。