張波 韋冰丹 甘坤寧 崔向榮 熊凱

南寧市第二人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科手外科，廣西 南寧 530031

股骨頭壞死是由于股骨頭血液供應(yīng)破壞或骨細(xì)胞死亡引起的病理過程，病變可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞、股骨頭塌陷及髖關(guān)節(jié)功能喪失等病情[1]。股骨頭壞死后期病情致殘率高，嚴(yán)重影響患者的健康水平和生活質(zhì)量。近年研究表明，非創(chuàng)傷性股骨頭壞死股骨頭局部BMP的表達(dá)過低，這可能是影響壞死骨修復(fù)與重建的重要原因。富血小板血漿(PRP)及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有修復(fù)軟組織功能和分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等功能[2]。本研究富血小板血漿聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基于BMP-2/Smads信號通路對兔股骨頭壞死的影響，為其進(jìn)一步研究開發(fā)提供科學(xué)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

新西蘭大白兔，SPF級，雌雄各半，體重2.6～3.2 kg，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，試驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK(桂)2011-0003，試驗(yàn)動(dòng)物合格證SCXK(桂)2011-0005。將新西蘭大白兔隨機(jī)分為：空白組、模型組、PRP(3%)組、BMSCs(1×106/mL)組、PRP(3%)+ BMSCs(1×106/mL)組，每組10只。

圖1 組織HE染色結(jié)果(×200)Fig.1 The results of HE staining (×200)HT6SS〗A：空白組 B：模型組 C：PRP組 D：BMSCs組 E：PRP + BMSCs組A: normal group; B: model group; C: PRP group; D: BMSCs group; E: PRP + BMSCs group

1.2 儀器與試劑

H-DMEM培養(yǎng)基：北京索來寶，批號：Lot.No.20140516；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清：賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司，批號：NWJ1473；胰蛋白酶：北京索來寶，批號：Lot.No.20140702；BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2抗體：武漢博士德生物工程公司；大腸桿菌內(nèi)毒素：Sigma 公司，批號：L-2630；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜及顯影設(shè)備：BIO-RAD公司；酶免分析儀：美國Thermo Forma公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1PRP制備：兔股靜脈取血5 mL，采用改良的Appel法[3]制備富血小板血漿，制備的PRP的終濃度為3%，備用。

1.3.2BMSCs培養(yǎng)：新生兔斷頸法處死，采用Kopen的方法[4]培養(yǎng)并純化出BMSCs細(xì)胞液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106/mL。

1.3.3兔股骨頭壞死模型的建立[5]及給藥方法：向新西蘭大白兔靜脈注射10 μg/kg大腸桿菌內(nèi)毒素兩次，注射間隔為24 h。第二次注射大腸桿菌內(nèi)毒素后，臀肌注射甲基強(qiáng)的松龍20 mg/kg，注射3次，每次注射間隔為24 h。甲基強(qiáng)的松龍注射4 w后，分別對不同實(shí)驗(yàn)組兔股骨頭內(nèi)髓芯減壓后注射RPR(0.4 mL 3%)、BMSCs(1 mL 1×106/mL)、BMSCs (1 mL 1×106/mL)+ PRP(0.4 mL 3%)，每周注射1次，連續(xù)注射4周?？瞻捉M及模型組不注入任何物質(zhì)。

1.3.4觀察指標(biāo)：造模12 w后處死動(dòng)物，切取股骨頭固定、包埋、切片、觀察病理學(xué)變化。對股骨頭進(jìn)行HE染色觀察兔股骨頭骨髓腔內(nèi)的病理學(xué)及骨陷窩空缺率變化情況。酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測血清中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的含量。蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測股骨頭中BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2的蛋白水平的變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)組織觀察

空白組軟骨細(xì)胞均勻，排列整齊；骨髓腔內(nèi)骨小梁完整，成骨細(xì)胞多。模型組軟骨細(xì)胞排列紊亂，大小不一，破骨細(xì)胞較多，脂肪細(xì)胞數(shù)量顯著增加。與模型組相比，PRP、BMSCs治療組軟骨細(xì)胞排列較整齊，成骨細(xì)胞有所增加，脂肪細(xì)胞明顯減少。

2.2 PRP與BMSCs對骨陷窩空缺率的影響

與空白組相比，模型組骨陷窩空缺率顯著增加(P<0.05)；與模型組相比，各治療組的骨陷窩空缺率明顯下降(P<0.05)。結(jié)果見圖2，表1。

圖2 PRP與BMSCs對骨陷窩空缺率的影響(×400)Fig.2 The effect of PRP and BMSCs on lacuna vacancy rate (×400)A：空白組 B：模型組 C：PRP組 D：BMSCs組 E：PRP+ BMSCs組A: normal group; B: model group; C: PRP group; D: BMSCs group; E: PRP + BMSCs group

組別骨陷窩空缺率(%)空白組5.74±1.05模型組21.31±1.94?PRP組16.08±1.87?▲BMSCs組14.25±1.19?▲PRP+ BMSCs組11.89±1.46?▲

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05

Notice： compared with normal group,*P<0.05; compared with model group,▲P<0.05

2.3 PRP與BMSCs對兔血清中VEGF的影響

與模型組相比，各治療組血清中 VEGF的含量均有所上升，差異有顯著性意義(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 PRP與BMSCs對兔血清中VEGF的影響Table 2 The effect of PRP and BMSCs on serum levels of VEGF in rabbits

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05

Notice： compared with normal group,*P<0.05; compared with model group,▲P<0.05

2.4 PRP與BMSCs對股骨頭中BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2表達(dá)的影響

與空白組相比，模型組股骨頭中BMP-2、Smad1、Smad5、Runx2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。與模型相比，各治療組股骨頭組織中的BMP-2、Smad1、Smad5、Run2蛋白水平明顯上升，其中PRP+BMSCs組水平上升地最高(P<0.05)。結(jié)果見表3，圖2。

組別BMP-2Smad1Smad5Runx2空白組0.55±0.120.42±0.150.31±0.100.46±0.15模型組0.39±0.11?0.21±0.08?0.17±0.07?0.28±0.06?PRP組0.67±0.08?▲0.56±0.14?▲0.42±0.19?▲0.57±0.17?▲BMSCs組0.74±0.14?▲0.62±0.15?▲0.53±0.08?▲0.65±0.22?▲PRP+ BMSCs組0.98±0.25?▲0.74±0.26?▲0.65±0.17?▲0.96±0.19?▲

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05

Notice： compared with normal group,*P<0.05; compared with model group,▲P<0.05

圖3 PRP與BMSCs對股骨頭中BMP-2、Smad1、Smad5、Run2表達(dá)的影響Fig.3 The effect of PRP and BMSCs on the expressions of BMP-2, Smad1, Smad5, and Run2 in the femoral head

3 討論

股骨頭壞死在臨床上可分為創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性兩大類別。外傷所致的股骨頭損傷、股骨頸骨折等引起股骨頭血運(yùn)障礙的股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制目前研究已經(jīng)基本明確[6]。激素、酒精、放射性損傷、一些全身性疾病等繁雜因素而造成的非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確[7,8]。因此針對性的治療比較困難，對股骨頭壞死最佳的治療方法仍在不斷的探索進(jìn)行中。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)是一種廣泛存在于骨基質(zhì)中的酸性糖蛋白，是轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β超家族中最大的一族?？赏ㄟ^體內(nèi)自分泌和旁分泌形式分泌出BMP，經(jīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并經(jīng)配體與細(xì)胞表面I型和II型BMP受體的結(jié)合，從而誘導(dǎo)骨、軟骨及骨相關(guān)結(jié)締組織的形成[9]。其中BMP-2是促進(jìn)骨形成和誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的細(xì)胞外信號分子。近年研究表明，非創(chuàng)傷性股骨頭壞死股骨頭局部BMP的表達(dá)過低，這可能是影響壞死骨修復(fù)與重建的重要原因。Smads蛋白在將TGF-β信號從細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的過程中起到關(guān)鍵性作用，分為9個(gè)亞型。BMP可激活Smad1、Smad5、Smad8的Smads蛋白亞型，從而誘導(dǎo)調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化的特異性轉(zhuǎn)錄Runx2的基因表達(dá)[10]。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一類中胚層來源的干細(xì)胞，為骨組織工程的首選種子細(xì)胞。在機(jī)體內(nèi)骨的形成和損傷后的修復(fù)中發(fā)揮著重要的作用[11]。富血小板血漿(PRP)是通過離心的方法從自體血中提取出來的血小板濃縮物。含有多種生長因子(TGF-β、VEGF)與纖維蛋白原。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PRP與BMSCs能改善股骨頭壞死的恢復(fù)情況，上調(diào)BMP-2、Smad1、Smad5、Run2蛋白的表達(dá)。且PRP與BMSCs的治療效果最好。可見PRP與BMSCs同時(shí)應(yīng)用時(shí)產(chǎn)生協(xié)同作用，PRP促進(jìn)BMSCs的增殖與分化，提供股骨修復(fù)中所需的生長因子，通過上調(diào)BM P-2的蛋白水平，激活Smads信號通路，繼而誘導(dǎo)調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化的特異性轉(zhuǎn)錄Runx2的基因表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化及骨的形成，加速骨組織的修復(fù)與愈合。