張振華　張榮明

(河南省人民醫(yī)院甲狀腺外科，河南　鄭州　450003)

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甲狀腺乳頭狀癌組織中核轉(zhuǎn)錄因子-κB的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

張振華張榮明1

(河南省人民醫(yī)院甲狀腺外科，河南鄭州450003)

〔摘要〕目的探討甲狀腺乳頭狀癌(PTC)組織中NF-κB的表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性。方法隨機(jī)選擇2013年2月至2015年6月于該院采取手術(shù)治療的PTC患者68例。取PTC癌組織以及對應(yīng)的癌旁組織分別進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測、Western印跡檢測以及免疫組化檢測；分析NF-κB表達(dá)與PTC患者病理特征的相關(guān)性。結(jié)果NF-κB mRNA及NF-κB 蛋白在PTC癌組織中的表達(dá)率顯著高于癌旁組織(P<0.05)。PTC癌組織的NF-κB /β-actin mRNA 以及NF-κB蛋白/GAPDH的灰度比值顯著高于癌旁組織(P<0.05)。NF-κB陽性表達(dá)在PTC癌組織中主要為陽性及強(qiáng)陽性，而在癌旁組織中則主要為弱陽性，組間差異顯著(P<0.05)。 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，NF-κB陽性表達(dá)與PTC患者的腫瘤直徑、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期均呈正相關(guān)(r=0.667，0.709，0.691；均P<0.05)。結(jié)論NF-κB在PTC患者組織中呈高表達(dá)，且NF-κB的高表達(dá)與PTC患者臨床病理特征聯(lián)系密切，在PTC患者疾病進(jìn)展中扮演著重要的角色。

〔關(guān)鍵詞〕甲狀腺乳頭狀癌；核轉(zhuǎn)錄因子-κB

乳頭狀甲狀腺癌(PTC)發(fā)病率較高，癌灶易發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移〔1〕。核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB在機(jī)體免疫反應(yīng)以及炎性反應(yīng)等多個(gè)反應(yīng)階段中均起到調(diào)控作用。有報(bào)道指出NF-κB有助于及時(shí)掌握腫瘤患者癌灶轉(zhuǎn)移以及疾病轉(zhuǎn)歸等情況〔2〕。本文旨在探討NF-κB與臨床病理特征的關(guān)系。

1資料和方法

1.1臨床資料隨機(jī)選擇2013年2月至2015年6月于我院采取手術(shù)治療的PTC患者68例，男31例，女37例，年齡41～72〔平均(57.6±1.9)〕歲。TNM分期Ⅰ～Ⅱ 38例，Ⅲ～Ⅳ期 30例。術(shù)中切除的PTC癌組織及對應(yīng)的癌旁組織均保存完整，入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者的疾病診斷與手術(shù)方案均符合世界衛(wèi)生組織關(guān)于PTC的定義與標(biāo)準(zhǔn)；(2)術(shù)前并未給予患者放、化療或免疫制劑類藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他種類癌癥；(2)非手術(shù)治療的PTC患者。

1.2研究方法

1.2.1RT-PCR檢測取PTC癌組織以及對應(yīng)的癌旁組織各0.1 g分別加進(jìn)1 ml的TRIzol試劑中提取出組織總RNA。再將1 μg的RNA模板經(jīng)購于Promega公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。將β-actin作為內(nèi)參，使用TaKaRa公司生產(chǎn)的RT-PCR試劑盒測定NF-κB mRNA的表達(dá)量。另取10 μl的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物增添2 μl的6×Loading Buffer，利用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在GDS800型凝膠成像系統(tǒng)中成像，對所得圖像進(jìn)行灰度分析。其中NF-κB 的擴(kuò)增引物是5′-AACTGTTCCCCCTCATCTTC-3′及5′-TCCTACAAGCTCGTGGGGGT-3′(269 bp)。β-actin的擴(kuò)增引物是5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′及5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′(498 bp)。相關(guān)反應(yīng)條件為94℃ 5 min，94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 45 s，循環(huán)35次，在72℃下延伸約10 min。

1.2.2Western印跡檢測取PTC癌組織及癌旁組織各0.1 g，在勻漿離心之后取其上清液，利用考馬斯亮藍(lán)G-250檢測核蛋白水平，調(diào)整至5 μg/L，在-70℃下保存?zhèn)溆谩槊總€(gè)泳道取50 μg的核蛋白，由聚丙烯酰胺凝膠行電泳分離，并電轉(zhuǎn)到PVDF膜。在封閉后，首先加入兔抗人NF-κB型單克隆抗體，而后添加與辣根過氧化物酶相結(jié)合的驢抗兔型二抗，利用化學(xué)發(fā)光試劑盒對雜交信號進(jìn)行檢測。將GAPDH作為內(nèi)參，通過分析軟件給予灰度分析。

1.2.3免疫組化檢測使用SP法測定NF-κB的表達(dá)情況。4%的多聚甲醛對標(biāo)本進(jìn)行固定，經(jīng)石蠟包埋，切片厚度4 μm，在脫蠟及水化組織切片后，利用0.1%的枸緣酸鹽緩沖液行抗原熱修復(fù)，再進(jìn)行SP免疫組化染色。使用二甲苯中性樹脂進(jìn)行封固，在顯微鏡下進(jìn)行觀察。將PBS代替一抗用于陰性對照。將胞質(zhì)/胞核呈現(xiàn)黃色或棕黃色，以及棕褐色顆粒視為陽性。為每張切片選取5個(gè)視野(400×)實(shí)施染色細(xì)胞評分，染色細(xì)胞數(shù)在計(jì)數(shù)細(xì)胞中占比<5%計(jì)0分，5%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分。染色強(qiáng)度：無染色計(jì)0分，黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。二者乘積0分計(jì)陰性(-)，1～4分計(jì)弱陽性(+)，5～8分計(jì)陽性()，9～12分計(jì)強(qiáng)陽性()。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、Pearson分析。

2結(jié)果

2.1NF-κB在不同組織中的表達(dá)情況NF-κB mRNA及NF-κB 蛋白在PTC癌組織中的表達(dá)率〔56例(82.35%)、58例(85.29%)〕顯著高于癌旁組織〔18例(26.47%)、23例(33.82%)〕(P<0.05)。

2.2兩組NF-κB /β-actin mRNA 以及NF-κB蛋白/GAPDH的灰度比值比較PTC癌組織的NF-κB /β-actin mRNA(0.91±0.13)以及NF-κB蛋白/GAPDH的灰度比值(9.44±0.38)顯著高于癌旁組織(0.38±0.15,1.83±0.25)(t=22.018,137.962,P<0.05)。

2.3不同組織免疫組化結(jié)果比較NF-κB陽性表達(dá)在PTC癌組織中主要為陽性及強(qiáng)陽性，陽性表達(dá)率為86.76%(-9例，+0例，32例，27例)，而在癌旁組織中則主要為弱陽性，陽性表達(dá)率為27.94%(-49例，+19例，及均為0例)，組間差異顯著(χ2=48.099,P<0.05)。

2.4NF-κB表達(dá)與PTC患者病理特征的關(guān)系腫瘤直徑≥1 cm、有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期者的NF-κB表達(dá)陽性率顯著高于腫瘤直徑<1 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期者(P<0.05)。見表1。

表1　NF-κB表達(dá)與PTC患者病理特征的關(guān)系(n)

2.5NF-κB陽性表達(dá)與PTC患者病理特征的相關(guān)性分析根據(jù)表4分析相關(guān)性可知，NF-κB陽性表達(dá)與PTC患者的腫瘤直徑、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及TNM分期均呈正相關(guān)(r=0.667，0.709，0.691；均P<0.05)。

3討論

NF-κB屬于轉(zhuǎn)錄因子類型蛋白家族，人體細(xì)胞內(nèi)含Rel、RelB、p65、p52及p50五種亞單位。p65、Rel以及RelB均具有N端同源區(qū)和具備反式激活功能的結(jié)構(gòu)域C端，其中同源區(qū)中存在一個(gè)特定核定位區(qū)域，可與DNA相結(jié)合，并參與核易位以及二聚體化，而反式激活區(qū)域則和轉(zhuǎn)錄活化等相關(guān)聯(lián)〔3〕。NF-κB能夠參與人體細(xì)胞分化、凋亡，產(chǎn)生胚胎組織和免疫以及感染、發(fā)生腫瘤等生理性、病理性反應(yīng)。已有報(bào)道，NF-κB在多種腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在異常高表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)其對于腫瘤浸潤以及轉(zhuǎn)移等起到的重要作用〔4〕。

本研究結(jié)果充分說明了NF-κB在癌組織中具有更高的表達(dá)量。由于NF-κB屬于早期型轉(zhuǎn)錄因子，其激活無需新翻譯蛋白給予調(diào)控，當(dāng)細(xì)胞受到有害刺激時(shí)，其能夠立即給予反應(yīng)〔5〕。因此，當(dāng)細(xì)胞膜表面出現(xiàn)有害刺激和受體相結(jié)合情況時(shí)，可以使NF-κB自身信號通路發(fā)生改變，進(jìn)而表達(dá)。而PTC組織內(nèi)通常具有大量炎性因子，且其微環(huán)境通常處于缺氧狀態(tài)，因此會刺激NF-κB活化，并向核內(nèi)部轉(zhuǎn)移〔6〕。病毒編碼類型癌蛋白也會導(dǎo)致NF-κB激活，進(jìn)而造成患者NF-κB水平高表達(dá)。NF-κB自身通路激活能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生以及發(fā)展，進(jìn)一步印證其對腫瘤癌變所起到的關(guān)鍵作用。主要表現(xiàn)為NF-κB活化高表達(dá)，其抗凋亡通路得到充分表達(dá)，能夠使細(xì)胞凋亡因子以及周期調(diào)節(jié)類蛋白表達(dá)水平受到抑制而呈低表達(dá)狀態(tài)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞避免了凋亡機(jī)制，形成克隆能力而不斷增殖〔7〕。Lin等〔8〕報(bào)道提出，血管內(nèi)皮生長因子是能夠促進(jìn)血管不斷形成的因子，其對于腫瘤發(fā)生以及轉(zhuǎn)移均起到關(guān)鍵作用。而NF-κB對于其具有明顯調(diào)控作用，當(dāng)NF-κB水平上升時(shí)，其水平得到顯著上調(diào)，造成腫瘤血管大量形成，且NF-κB激活之后還會導(dǎo)致控制PTC發(fā)生高轉(zhuǎn)移的細(xì)胞因子表達(dá)水平上升，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。因此，NF-κB激活直接影響PTC的生長及轉(zhuǎn)移。同時(shí)，相關(guān)性分析結(jié)果再次表明NF-κB陽性表達(dá)與患者的臨床病理特征存在較大的聯(lián)系，值得深入研究。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-12-10修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

基金項(xiàng)目：遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.2014022035)

通訊作者：張榮明(1974-)，男，碩士，教授，主要從事燒傷整形研究。

〔中圖分類號〕R73

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3198-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.050

1遼寧醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院

第一作者：張振華(1974-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事甲狀腺外科研究。