李亞芹　臧學(xué)麗　馮賀達(dá)　楊　婷　章春宇

(長春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，吉林　長春　130031)

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異葒草素對(duì)老年耐藥性前列腺癌的逆轉(zhuǎn)作用

李亞芹臧學(xué)麗馮賀達(dá)楊婷章春宇1

(長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林長春130031)

〔摘要〕目的探討異葒草素對(duì)耐藥性前列腺癌的逆轉(zhuǎn)作用機(jī)制。方法利用細(xì)胞增殖檢驗(yàn)試劑盒(MTS)檢測(cè)細(xì)胞活性，用流式細(xì)胞儀及Hoechst33342熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western印跡檢測(cè)間質(zhì)樣改變及相關(guān)蛋白。結(jié)果MTS檢測(cè)細(xì)胞活性發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用異葒草素、紫杉醇時(shí)細(xì)胞抑制率增加并不明顯，而兩者聯(lián)合可明顯增加抑制率。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡顯示，當(dāng)異葒草素聯(lián)合紫杉醇作用于耐藥細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡可達(dá)57.26%。Hoechst33342熒光染色也發(fā)現(xiàn)二者共同作用時(shí)細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色，出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、致密濃染、顏色發(fā)白等凋亡特征。Western 印跡檢測(cè)E-cadherin、Notch-1表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)異葒草素能增加E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)抑制Notch-1表達(dá)。結(jié)論異葒草素能夠逆轉(zhuǎn)前列腺癌細(xì)胞PC3-TxR的耐藥情況，其作用機(jī)制可能是通過增加E-cadherin、抑制Notch-1的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

〔關(guān)鍵詞〕耐藥；前列腺癌；異葒草素

前列腺癌是一種激素依賴腫瘤，為老年男性常見疾病〔1〕。異葒草素是一種黃酮類物質(zhì)，在西番蓮、葒草及竹葉等植物中有豐富的含量〔2,3〕。已有研究證實(shí)異葒草素具有抗腫瘤、抗感染、抗氧化等作用〔4,5〕，但其對(duì)逆轉(zhuǎn)耐藥腫瘤的作用目前尚無報(bào)道。本研究旨在探討異葒草素對(duì)老年前列腺癌患者耐藥的逆轉(zhuǎn)作用。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料和儀器前列腺癌耐藥細(xì)胞株P(guān)C3-TxR由吉林大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)。異葒草素，上海永恒生物科技；細(xì)胞增殖檢驗(yàn)試劑盒(MTS)，美國Sigma；二甲基亞硫(DMSO)，美國MP Biomedicals；RPML-1640培養(yǎng)基，吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，BIOBOX；胎牛血清、胎牛血清白蛋白(BCA)定量，美國Thermo Scientific；脫脂奶粉的Tris鹽酸緩沖液(TBST)、四甲基乙二胺(TEMED)、瓊脂糖，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Hoechst33342，美國Sigma；兔抗人E-cadherin、兔抗人Notch-1、β-actin，美國Cell Signaling Technology；二抗，上海生工生物工程有限公司；PVDF膜，美國Millipore。

超凈工作臺(tái)，德國Heraeus；培養(yǎng)瓶，美國BD Falcon；離心機(jī)，美國Sigma；96孔板，美國Coring；酶標(biāo)儀Gen5 1.10，美國BioTek；流式細(xì)胞儀，美國BD FACS Calibur；Ckx41倒置熒光顯微鏡，日本Olympus；220 V電泳供電裝置PowerPac、165-8001型伯樂小型垂直電泳、221BR Trans-Bolt SD半干轉(zhuǎn)印槽、ChemiDox XRS 凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad。

1.2方法

1.2.1MTS檢測(cè)細(xì)胞活性將處于對(duì)數(shù)生長期的1×104/L PC3-TxR接種到96孔板上，每孔200 μl。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中24 h。棄去上清，磷酸緩沖液(PBS)洗滌1次。異葒草素組加入400 μl 40 μmol/L異葒草素；紫杉醇組加入4 mg/ml紫杉醇400 μl；混合組加入40 μmol/L異葒草素200 μl，4 mg/ml紫杉醇200 μl；空白對(duì)照組加入等量的細(xì)胞培養(yǎng)液。每組設(shè)5組復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，在結(jié)束培養(yǎng)前4 h向各孔中加入10 μl MTS，混勻后待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后棄去上清液，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm處的吸光值。抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/細(xì)胞組OD值)×100%。

1.2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況將對(duì)數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，之后按1.2.1中分組加入藥物，作用48 h后收集細(xì)胞，常溫1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，使用預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞后再次按上述條件離心，重復(fù)2次。將收集的細(xì)胞用預(yù)冷75%乙醇固定。再次離心后棄去固定液，PBS洗滌2次。加入200 μl碘化丙啶(PI)，置于4℃環(huán)境25 min。400目篩網(wǎng)過濾1次后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.3Hoechst33342熒光染色將處于對(duì)數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞接種于96孔板中，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁生長24 h后，按上述分組情況加入相應(yīng)藥物。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中24 h。之后棄去上清液，PBS洗滌2次，以醋酸∶甲醇1∶3(V/V)室溫固定10 min。棄去固定液，加入10 μg/ml Hoechst33342染液覆蓋細(xì)胞，37℃恒溫箱中染色10 min，棄去上清液后PBS洗滌，洗掉殘留染料，避光放置，340 nm激發(fā)熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4Western 印跡將上述分組后處理的細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取，并將蛋白溶液的濃度配置為相同。配制15%分離膠，4%濃縮膠，30 g蛋白樣品上樣，調(diào)整電壓100 V電泳2 h，之后90 V電壓聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)膜90 min，室溫下牛奶封閉1 h，1∶1 000的E-cadherin、Notch-1，4℃過夜，TBST洗滌3次，5 min/次。加入1∶5 000二抗室溫下反應(yīng)1 h，再次使用TBST洗滌。化學(xué)法發(fā)光反應(yīng)、曝光、拍照并進(jìn)行灰度值分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1MTS檢測(cè)細(xì)胞活性除異葒草素作用24 h后細(xì)胞抑制率與對(duì)照組無明顯差異外，其余各組與對(duì)照組相比對(duì)耐藥細(xì)胞的抑制率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。單純使用異葒草素或紫杉醇作用于耐藥細(xì)胞抑制率均未達(dá)到50%，但二者共同作用后抑制率明顯增加。考慮異葒草素能夠逆轉(zhuǎn)耐藥。見圖1。

圖1　MTS檢測(cè)細(xì)胞活性

2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡單獨(dú)使用異葒草素及紫杉醇作用細(xì)胞48 h后細(xì)胞凋亡率為23.54%、37.23%，均未達(dá)到50%，可見促進(jìn)細(xì)胞凋亡的情況并不理想，二者共同作用后凋亡率為57.26%?？梢姰惾嚥菟芈?lián)合紫杉醇后細(xì)胞的耐藥情況得到改善。

2.3Hoechst33342熒光染色當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)Hoechst33342進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色，細(xì)胞核固縮、致密濃染，顏色發(fā)白。對(duì)照組及異葒草素組的細(xì)胞藍(lán)染，但細(xì)胞核固縮及致密不明顯，此時(shí)細(xì)胞凋亡的量少。紫杉醇作用細(xì)胞后出現(xiàn)明顯核固縮、致密、顏色發(fā)白。當(dāng)異葒草素聯(lián)合紫杉醇時(shí)上述現(xiàn)象更加明顯。見圖2。

2.4Western 印跡檢測(cè)對(duì)照組與紫杉醇組的E-cadherin、Notch-1表達(dá)情況一致，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而異葒草素組及混合組E-cadherin明顯增多，Notch-1明顯減少，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見圖3。

與對(duì)照組相比：1)P<0.05圖3　Western 印跡對(duì)耐藥蛋白的檢測(cè)

3討論

由于前列腺癌起病隱匿，故患者發(fā)現(xiàn)時(shí)大多已進(jìn)入疾病的晚期階段。目前治療前列腺癌的主要手段有雄激素阻斷、外科手術(shù)等，但治療效果平平；并且耐藥前列腺癌讓臨床治療更加困難〔6〕。

有文獻(xiàn)報(bào)道耐藥細(xì)胞的形態(tài)呈梭形，細(xì)胞間疏散，呈間質(zhì)樣形態(tài)改變，例如肺癌、乳腺癌等〔7〕。本研究通過Western 印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)了耐藥的前列腺癌細(xì)胞發(fā)生了間質(zhì)樣形態(tài)改變，同時(shí)異葒草素可以增加E-cadherin改變這一過程。本實(shí)驗(yàn)中異葒草素能夠明顯減少Notch-1的表達(dá)，從而使耐藥前列腺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性增加。

4參考文獻(xiàn)

1 唐志柳，白潔，顧麗娜，等.2000～2010 年我國前列腺癌和乳腺癌流行狀況的系統(tǒng)性綜述〔J〕.中國腫瘤，2013；22(4):260-5.

2竇妍，翟延君，佟苗苗，等.HPLC 測(cè)定不同采收期葒草中葒草素、異葒草素的含量〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012；18(2):62-4.

3Lim JH，Park HS，Choi JK，etal.Isoorientin induces Nrf2 pathway-driven antioxidant response through phosphatidylinositol 3-kinase signaling〔J〕.Arch Pharmacal Res, 2007;30(12):1590-8.

4Park HS，Lim JH，Kim HJ，etal.Antioxidant flavone glycosides from the leaves of sasa borealis〔J〕.Arch Pharm Res,2007；30(2):161-6.

5Conforti F，Rigano D，Menichini F，etal.Protection against neurodegenerative diseases of Iris pseudopumila extracts and their constituents〔J〕.Fitoterapia,2009；80(1):62-7.

6韓蘇軍,張思維,陳萬青，等.中國前列腺癌發(fā)病現(xiàn)狀和流行趨勢(shì)分析〔J〕.臨床腫瘤學(xué)雜志，2013；18(4):330-4.

7Chen D,Huang J,Zhang K,etal.MicroRNA-451 induces epithelial-mesenchymal transition in docetaxel-resistant lung adenocarcinoma cells by targeting proto-oncogene c-Myc〔J〕.Eur J Cancer，2014；50(17):3050-67.

〔2015-12-20修回〕

(編輯袁左鳴/騰欣航)

通訊作者：章春宇(1970-)，女，主任藥師，主要從事藥品質(zhì)量控制研究。

〔中圖分類號(hào)〕R73

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)13-3142-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.021

1長春健康教育中心

第一作者：李亞芹(1964-)，女，副教授，主要從事生物藥物研發(fā)研究。