張世應(yīng)　凃　靜

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院藥劑科，湖北　武漢　430000)

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阿托伐他汀對膿毒癥大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用及對細(xì)胞炎性蛋白-2和Toll樣受體-4表達(dá)的影響

張世應(yīng)凃靜1

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院藥劑科，湖北武漢430000)

〔摘要〕目的探討阿托伐他汀對膿毒癥大鼠急性肺損傷(ALI)的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。方法采用盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)方法構(gòu)建大鼠膿毒癥ALI模型，40只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(S組)、模型組(M組)、阿托伐他汀低劑量組(L組，20 mg/kg)和阿托伐他汀高劑量組(H組，40 mg/kg)，阿托伐他汀治療組術(shù)后6 h和18 h腹腔注射不同劑量的阿托伐他汀，S、M組同時間給予等量的生理鹽水腹腔注射。術(shù)后20 h處死大鼠收集血液及肺組織標(biāo)本。測定實(shí)驗(yàn)各組動脈血?dú)庵笜?biāo)、肺水含量、支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量及細(xì)胞計(jì)數(shù)；酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測血清中細(xì)胞炎性蛋白(MIP)-2及Toll樣受體(TLR)-4水平；反轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測肺組織MIP-2及TLR-4 mRNA的表達(dá)。結(jié)果與M組比較，動脈血?dú)庵笜?biāo)、肺水含量、支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量及細(xì)胞計(jì)數(shù)在L組、H組均顯著改善(P<0.05)，且H組改善更明顯(P<0.05)。與M比較，阿托伐他汀干預(yù)組血清MIP-2及TLR-4水平和肺組織MIP-2及TLR-4 mRNA的表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，且H組改善更明顯(P<0.05)。結(jié)論阿托伐他汀對膿毒癥大鼠ALI具有保護(hù)作用，這種保護(hù)作用可能與其抑制MIP-2及TLR-4表達(dá)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕阿托伐他??；膿毒癥；肺損傷；細(xì)胞炎性蛋白-2；Toll樣受體-4

膿毒癥極易引起急性肺損傷(ALI)〔1〕。盡管針對膿毒癥所致ALI在臨床上采用多種新型抗生素和強(qiáng)效血管活藥物進(jìn)行治療，但其所取得的效果還很有限。有研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀對膿毒癥ALI具有一定的保護(hù)作用〔2〕。本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用阿托伐他汀對盲腸結(jié)扎穿孔(CLP) 模型的膿毒癥大鼠肺損傷進(jìn)行干預(yù)，觀察阿托伐他汀治療后多項(xiàng)動脈血?dú)庵笜?biāo)、肺水含量、支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量及細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化，并檢測血清和肺組織中巨噬細(xì)胞炎性蛋白2(MIP-2)及Toll樣受體4(TLR-4)表達(dá)水平，初步探討阿托伐他汀對膿毒癥大鼠肺損傷的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。

1材料與方法

1.1動物成年健康雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量190～250 g，購于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物飼養(yǎng)與研究中心。所有SD大鼠飼養(yǎng)于12 h晝夜交替的溫控房中適應(yīng)環(huán)境，術(shù)前不禁食水。40只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(S組)、模型組(M組)、阿托伐他汀低劑量組(L組，20 mg/kg)和阿托伐他汀高劑量組(H組，40 mg/kg)，每組10只。

1.2模型構(gòu)建及治療方法采用盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)方法構(gòu)建膿毒癥ALI大鼠模型，具體操作步驟參見文獻(xiàn)報(bào)道〔3〕。阿托伐他汀治療組術(shù)后6 h和18 h腹腔注射不同劑量(20 mg/kg、40 mg/kg)的阿托伐他汀，S、M組同時間給予等量的生理鹽水腹腔注射。

1.3標(biāo)本獲取及檢測方法術(shù)后20 h處死大鼠收集血液及肺組織標(biāo)本，具體方法為對大鼠進(jìn)行麻醉后，經(jīng)由腹主動脈置入導(dǎo)管抽取0.5 ml血液，隨后立即開胸取出肺組織。采用全自動血?dú)夥治鰴C(jī)(NOVA-K型，美國)檢測氧分壓(PaO2)水平和PaO2/吸入氧體積分?jǐn)?shù)(FiO2)值。肺水含量測定具體方法：在開胸取出肺組織時立即進(jìn)行稱重，取得濕重，隨后將肺組織置入80℃烤箱中烘烤至恒重后稱重，取得干重，計(jì)算二者比值得出肺水含量。支氣管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白含量經(jīng)由二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行測定，具體操作步驟參見試劑盒(Thermo公司)說明書。BALF中中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞水平檢測步驟，BALF經(jīng)離心后沉淀以100 μl鹽水重懸，離心后圖片，進(jìn)行瑞-吉氏染色，光鏡下計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞水平。

1.4酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)MIP-2及TLR-4 ELISA檢測試劑盒購自上海復(fù)蒙基因生物科技有限公司。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作檢測血清MIP-2及TLR-4水平。

1.5反轉(zhuǎn)錄PCR方法Trizol提取組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃10 s，60℃ 20 s，共40個循環(huán)。引物序列：MIP-2上游引物：5′-CCTCAACGGGCAGAATCAAAG-3′，下游引物：5′-CAAGACATGAGAAAGCATGA-3′；TLR-4上游引物：5′-CCTTAAAGAAACTAAATGTGGCTCA-3′，下游引物：5′-TCTAAAGAGAGATTGACTTGGGGAT-3′；內(nèi)參照GAPDH上游引物：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游引物：5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。得到的序列行瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行電泳鑒。紫外燈下觀察結(jié)果。密度掃描、結(jié)果分析：采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對電泳條帶進(jìn)行密度掃描。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0 軟件進(jìn)行ANOVA檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1動脈血?dú)庵笜?biāo)檢測結(jié)果與S組相比，M組PaO2水平和PaO2/FiO2值均顯著降低(P<0.01)；L組、H組均顯著高于M組(P<0.05)，且H組顯著高于L組(P<0.05)。見表1。

2.2肺水含量和BALF中蛋白含量檢測結(jié)果與S組相比，M組肺水含量和BALF中蛋白含量均顯著升高(P<0.01)；L組、H組均顯著低于M組(P<0.05)，且H組均顯著低于L組(P<0.05)。見表2。

2.3BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果與S組相比，M組BALF中中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞水平均顯著升高(P<0.01)；L組、H組均顯著低于M組(P<0.05)，且H組均顯著低于L組(P<0.05)。見表3。

2.4血清中細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1及MIP-2表達(dá)水平及肺組織ICAM-1及MIP-2 mRNA表達(dá)情況檢測與S組相比，M組血清中ICAM-1、MIP-2及肺組織ICAM-1、MTP-2 mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)；L組、H組均顯著低于M組(P<0.05)，且H組均顯著低于L組(P<0.05)。見圖1，表4。

表1　動脈血?dú)庵笜?biāo)檢測結(jié)果

與S組相比:1)P<0.01；與M組相比:2)P<0.05;下表同

表2　肺水含量和BALF中蛋白含量檢測

表3　BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

表4　血清MIP-2及TLR-4水平

圖1　ICAM-1及MIP-2表達(dá)情況檢測

3討論

ALI和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS )是目前臨床兩大高死亡率的呼吸系統(tǒng)疾病〔4〕。ALI患者臨床死亡率約為34%～58%。本研究結(jié)果提示通過CLP方法構(gòu)建的膿毒癥大鼠肺損傷模型是成功的。同時，本研究還結(jié)果提示阿托伐他汀對膿毒癥所致ALI具有治療作用。

目前關(guān)于阿托伐他汀治療膿毒癥ALI的機(jī)制很少有文獻(xiàn)報(bào)道。在樹突細(xì)胞中，阿托伐他汀可通過 PI3K/Akt/Nrf2 途徑抑制血管緊張素2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)〔5〕。在肺動脈高壓大鼠模型中，阿托伐他汀具有抑制RhoA/Rho 激酶通路和核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB通路激活的作用〔6〕。同時文獻(xiàn)報(bào)道，阿托伐他汀可通過調(diào)節(jié)TLR依賴性的炎癥信號通路，進(jìn)而對膿毒癥發(fā)揮保護(hù)作用〔7〕。MIP-2屬于趨化因子C-X-C亞家族成員之一，研究顯示其對中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞具有很強(qiáng)的趨化作用〔8〕，而ALI的發(fā)生與中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞在肺組織局部的聚集關(guān)系密切。TLR是一種跨膜受體蛋白，是識別病原相關(guān)分子模式的受體。研究顯示，白藜蘆醇可通過調(diào)節(jié)TLR-4的表達(dá)而對膿毒癥大鼠ALI發(fā)揮保護(hù)作用〔9〕。據(jù)此推測阿托伐他汀可能是通過調(diào)節(jié)MIP-2及TLR-4的表達(dá)而發(fā)揮膿毒癥ALI的保護(hù)作用。

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〔2015-01-26修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：凃靜(1975-)，女，副主任藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)研究。

〔中圖分類號〕R5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3140-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.020

1華潤武鋼總醫(yī)院藥械中心

第一作者：張世應(yīng)(1974-)，男，主管藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)研究。