尚　冰　叢培瑋　王軼蓉　吳兆利

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)文獻(xiàn)研究院,遼寧　沈陽　110847)

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龜鹿二仙膏對人子宮內(nèi)膜基質(zhì)增殖及纖維連接蛋白表達(dá)的影響

尚冰叢培瑋1王軼蓉2吳兆利3

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)文獻(xiàn)研究院,遼寧沈陽110847)

〔摘要〕目的觀察龜鹿二仙膏對人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(hESCs)增殖功能，纖維連接蛋白(FN)表達(dá)的影響。方法體外培養(yǎng)hESCs，細(xì)胞貼壁達(dá)75%后對細(xì)胞純度通過免疫組化法進(jìn)行鑒定。實驗分成對照組、10-4mol/L龜鹿二仙膏組、10-6mol/L龜鹿二仙膏組、10-8mol/L龜鹿二仙膏組及雌二醇組，各組細(xì)胞無血清培養(yǎng)同步化24 h后，選取24 h、36 h、48 h分別處理細(xì)胞。應(yīng)用MTT比色法檢測細(xì)胞增殖率；Real-time PCR法檢測細(xì)胞FN基因的相對表達(dá)量；Western 印跡法檢測細(xì)胞FN蛋白含量。結(jié)果細(xì)胞波形蛋白鑒定陽性率達(dá)95%。龜鹿二仙膏含藥血清對hESCs增殖呈時間及劑量依賴性，10-4mol/L龜鹿二仙膏組在培養(yǎng)36 h、48 h后能顯著上調(diào)細(xì)胞增殖率。FN mRNA及蛋白表達(dá)在10-4mol/L龜鹿二仙膏組作用72 h后上升最為顯著，明顯高于對照組(P<0.01)，且與雌二醇組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論10-4mol/L龜鹿二仙膏可顯著促進(jìn)hESCs增殖，且呈時間及劑量依賴性?？稍诜肿铀缴险{(diào)FN 表達(dá)，可能與其治療女性生殖健康機制相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕龜鹿二仙膏；子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞；纖維連接蛋白；雌二醇

龜鹿二仙膏是著名的抗衰老膏方，由鹿角膠、龜板膠、枸杞子、人參組成，具有生精、益氣、養(yǎng)血的功效，古醫(yī)籍中多見有運用該方調(diào)理女性健康?，F(xiàn)代臨床文獻(xiàn)報道稱龜鹿二仙膏對改善女性血液循環(huán)，提高性激素含量有顯著療效〔1，2〕。但未見有本方針對女性生殖健康調(diào)理和疾病治療的臨床及實驗研究。子宮內(nèi)膜是一個由激素調(diào)節(jié)，經(jīng)歷動態(tài)改變的組織，在性激素的作用下，內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)生周期性的變化。人體性腺激素和生物活性分子通過介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-基質(zhì)間的聯(lián)系，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性的形成，促進(jìn)子宮內(nèi)膜-囊胚間的對話，保證囊胚的正常植入〔3〕。子宮內(nèi)膜對性腺激素的反應(yīng)是女性子宮生殖能力的重要體現(xiàn)。本研究探討龜鹿二仙膏對人子宮內(nèi)膜基質(zhì)增殖細(xì)胞(hESCs)及纖維連接蛋白(FM)表達(dá)的影響。

1材料和方法

1.1材料來源選取2014年5～11月遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科因婦科良性疾病行腹腔鏡檢查患者15例，年齡25～45歲，術(shù)后病理顯示為正常增生期子宮內(nèi)膜，術(shù)前3個月未應(yīng)用過激素類藥物，刮宮獲取足夠數(shù)量的子宮內(nèi)膜，轉(zhuǎn)移至4℃保存的裝有細(xì)胞培養(yǎng)液的小瓶中，將小瓶置于低溫保溫桶內(nèi)0.5 h內(nèi)送至實驗室，所取標(biāo)本均與患者簽署知情同意書。

1.2藥品及試劑龜鹿二仙膏(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽醫(yī)院藥局制)；DMEM-F12培養(yǎng)液、胎牛血清(Hyclone)；青鏈霉素混合液(Genview)；膠原酶、人雌二醇(Sigma)；兔抗人波形蛋白抗體；兔抗人FN一抗、鼠抗人β-肌動蛋白(β-actin)一抗(Santa)；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒(TaKaRa)。

1.3主要儀器Heal Fore Neofuge13 臺式高速冷凍離心機(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；TU-1810PC型紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；MycyclerTMThermal CyclerPCR擴增儀(BIO-RAD)；EPS天能電泳儀(上海天能科技有限公司)。

1.4方法

1.4.1組織處理與細(xì)胞培養(yǎng)參照Arnold等〔4〕法分離并獲取hESCs。超凈工作臺取出內(nèi)膜組織，無菌培養(yǎng)皿中PBS洗3遍。剪至1 mm3碎片，置0.125%膠原酶，37℃消化60 min，每5 min拍打一次，培養(yǎng)液終止消化。38μm不銹鋼網(wǎng)過濾，離心1 200 r/min，15 min，收集細(xì)胞，接種在10%FBS D-F12培養(yǎng)瓶中(5×105～6×105/ml)，37℃、5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h換液，細(xì)胞貼壁達(dá)90%以上后1∶3傳代。

1.4.2含藥血清的制備取SD雄性大鼠20只，隨機分為2組，每組10只。龜鹿二仙膏組灌胃給藥量按成人日臨床劑量，經(jīng)人/鼠體表面積換算為成人劑量，2次/d，每次3.5 ml(含生藥量為2.64 g/ml)，7 d。對照組大鼠每天灌服等量生理鹽水。末次給藥1 h后股動脈取血，分離血清，56℃恒溫30 min滅活補體，過濾分裝，-20℃短期保存?zhèn)溆?。按以上方法用同體積生理鹽水灌胃，制備生理鹽水血清，用作對照。

1.4.3細(xì)胞分組與處理取第2代hESCs，胰酶消化，細(xì)胞貼壁達(dá)75%以上后接種于24孔板，無血清同步化培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，分設(shè)對照組、10-4mol/L龜鹿二仙膏組、10-6mol/L龜鹿二仙膏組、10-8mol/L龜鹿二仙膏組及雌二醇組。對照組加入對照血清培養(yǎng)液；不同劑量龜鹿二仙膏組按培養(yǎng)液所含含藥血清濃度，設(shè)10-4mol/L、10-6mol/L、10-8mol/L 3個劑量組；雌二醇組加入10-6mol/L雌二醇培養(yǎng)液。每組8孔，每孔3復(fù)孔。37℃、5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24 h、36 h、48 h。

1.4.4Real-time PCR測定FN mRNA表達(dá)按實驗分組處理細(xì)胞，分別在24 h、36 h、48 h收集細(xì)胞，RNAiso Plus 試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計檢測RNA純度。去除基因組DNA，反轉(zhuǎn)錄RT反應(yīng)，SYBR Green I相對定量分析。反轉(zhuǎn)錄按如下條件反應(yīng)：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存。實時定量PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 s，95℃ 20 s，60℃ 35 s，32個循環(huán)。引物序列：FN基因上游5’-TAGCCCTGTCCAGGAGTTCA-3’,下游5’-CTGCAAGCCTTCAATAGTCA-3’；β-actin基因上游5’-GCACAGCCTGGATAGCA-3’,下游5’-CACCAACTGGGACGACAT-3’。

1.4.5Western 印跡測定FN蛋白含量按實驗分組處理細(xì)胞，分別在24 h、48 h、72h收集細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法蛋白定量。每孔80 μg蛋白150 V恒壓電泳30 min，半干轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉常溫?fù)u床封閉2h，加入兔抗IGF-1(或FN)一抗(1∶100)，4℃過夜。TBST洗膜3次，15 min/次；二抗常溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，15 min/次，化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗。

2結(jié)果

2.1龜鹿二仙膏對FN mRNA表達(dá)的影響與對照組比較，24、36、48 h FN mRNA的表達(dá)均有不同程度的升高(P<0.05，P<0.01)，且呈時間及劑量依賴性。而10-4mol/L龜鹿二仙膏組作用hESCs 48 h后FN mRNA的表達(dá)升高最為顯著(P<0.01)，與雌二醇組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1　不同時間各組hESCs中FN mRNA表達(dá)變化

與對照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01;與雌二醇組比較：3)P<0.05,4)P<0.01;與10-4mol/L龜鹿二仙膏組比較：5)P<0.05；6)P<0.01；下表同

2.2龜鹿二仙膏對FN蛋白表達(dá)的影響與對照組比較，24、36、48 h FN mRNA的表達(dá)均有不同程度的升高(P<0.05，P<0.01)，且呈時間及劑量依賴性。10-4mol/L龜鹿二仙膏組作用hESCs 48 h，對FN蛋白的表達(dá)促進(jìn)作用最為顯著(P<0.01)，與雌二醇組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異。見表2，圖1。

表2　不同時間各組大鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞FN蛋白表達(dá)變化

1：對照組；2：10-8 mol/L龜鹿二仙膏組；3：10-6 mol/L龜鹿二仙膏組；4：10-4mol/L龜鹿二仙膏組；5：10-6mol/L雌二醇組圖1　龜鹿二仙膏對FN蛋白表達(dá)的影響

3討論

生殖健康與提高生命質(zhì)量密切相關(guān)雌激素替代療法被認(rèn)為是治療圍絕經(jīng)期女性疾病及亞健康調(diào)理的有效方法，但雌激素長期應(yīng)用的依從性較差，時期應(yīng)用受到一定限制〔5〕。雌激素替代療法的副作用一直是醫(yī)學(xué)界爭論的焦點，中醫(yī)養(yǎng)生調(diào)理在促進(jìn)生殖健康以及亞健康干預(yù)中顯示了其獨特的優(yōu)勢和作用。

龜鹿二仙膏是古代著名填精益髓，益氣養(yǎng)血之膏方。其方首見于《醫(yī)方考·虛損勞瘵門》，因符合女性生理和病理特點，龜鹿二仙膏為許多著名中醫(yī)婦科專家臨床應(yīng)用于女性健康調(diào)理。方中鹿角膠甘咸而性溫，功善溫腎壯陽補益精血。龜板膠甘咸而性寒，長于填補精髓滋養(yǎng)陰血，二味能峻補陰陽以生氣血精髓共為君藥。配伍人參補后天脾胃之中氣，以增強化生氣血之源。枸杞子益肝腎補精血以助龜、鹿之功均為臣藥。四藥為伍陰陽并補氣血兼顧共成陰陽氣血交補之劑具有滋陰填精、益氣壯陽之功。劉同祥等〔6〕發(fā)現(xiàn)給大鼠灌胃服藥10 d后，前列腺和精囊腺的重量均有所增加。俞麗霞〔7〕研究證實龜鹿二仙膏能明顯增加未成年小鼠、大鼠和去勢大鼠包皮腺、精液囊和前列腺重量，升高去勢雄性大鼠血清皋酮水平和腎陽虛小鼠血中cMAP、GMP含量及脾細(xì)胞脫氧核糖核酸合成率，能有效防治腎陽虛小鼠附性器官萎縮，提高去勢大鼠陰莖電刺激興奮性，明顯縮短大鼠交配撲捉和射精潛伏期。

子宮內(nèi)膜在性激素的作用下發(fā)生周期性的變化，性激素能促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞有絲分裂，促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖，引起子宮內(nèi)膜基底層和腺體、間質(zhì)、血管增生、增厚〔8〕。而基質(zhì)細(xì)胞在上皮細(xì)胞的發(fā)育、生長和功能方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，其還有可能參與性激素對上皮細(xì)胞的增殖作用〔9〕。子宮內(nèi)膜對性腺激素的反應(yīng)是女性子宮生殖能力的重要體現(xiàn)。FN廣泛存在于細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜及各種體液中，通過與細(xì)胞膜上相應(yīng)的整合素蛋白結(jié)合介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的黏附，調(diào)控細(xì)胞遷移、增殖及分化等過程，在胚胎植入和妊娠的維持中發(fā)揮重要作用，并廣泛參與組織損傷的修復(fù)、感染性炎癥的發(fā)生及白細(xì)胞浸潤炎癥組織等活動〔10〕。一系列研究顯示，IGF-1可通過與其受體結(jié)合誘導(dǎo)FN表達(dá)，阻止FN與細(xì)胞結(jié)合進(jìn)而抑制細(xì)胞有絲分裂作用〔11〕。動物研究顯示〔12〕雌激素通過改變子宮內(nèi)膜FN含量可能是其調(diào)控胚泡著床的機制之一，與卵巢激素、細(xì)胞因子等形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，共同參與女性生殖生理調(diào)節(jié)。本項目前期臨床實驗顯示，龜鹿二仙膏對圍絕經(jīng)期綜合征女性患者治愈率高達(dá)93.75%〔13〕，但龜鹿二仙膏對人子宮內(nèi)膜雌激素靶基因FN表達(dá)影響的研究尚屬空白。

本文結(jié)果提示10-4mol/L龜鹿二仙膏能夠顯著上調(diào)及標(biāo)志性功能蛋白水平，其可能通過上調(diào)FN表達(dá)，促進(jìn)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的增殖率，進(jìn)而促進(jìn)子宮內(nèi)膜血管增生、增厚，提高女性生殖能力恢復(fù)。本研究繼承和挖掘古代傳統(tǒng)膏方在女性健康方面的應(yīng)用潛力，旨在為中醫(yī)膏方應(yīng)用于女性健康維護(hù)和亞健康干預(yù)提供科學(xué)實驗依據(jù)，至于是否具有其他影響機制，有待進(jìn)一步研究。

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〔2015-10-17修回〕

(編輯曹夢園)

基金項目：遼寧省科技廳科技攻關(guān)層次計劃項目(2012225018)

通訊作者：吳兆利(1965-)，女，醫(yī)學(xué)博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥對臟腑調(diào)控作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制研究。

〔中圖分類號〕R274

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3135-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.018

1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實驗中心2遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科

3遼寧中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院

第一作者：尚冰(1974-)，男， 副教授，醫(yī)學(xué)博士，主要從事中醫(yī)藥對臟腑調(diào)控作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制研究。