王　闖　王明娟　王一帆　齊潔敏

(承德醫(yī)學(xué)院病理教研室，河北　承德　067000)

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宮頸鱗癌整合素α5β1蛋白和乙酰肝素酶蛋白的表達(dá)及生物學(xué)行為

王闖王明娟王一帆齊潔敏

(承德醫(yī)學(xué)院病理教研室，河北承德067000)

〔摘要〕目的探討宮頸鱗癌組織中整合素α5β1蛋白和乙酰肝素酶(HPA)蛋白的表達(dá)及臨床意義。方法應(yīng)用組織芯片技術(shù)結(jié)合免疫組化方法(SP法)檢測(cè)68例宮頸鱗癌組織和20例宮頸正常組織整合素α5β1蛋白和乙酰肝素酶(HPA)蛋白表達(dá)情況，分析兩者在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)相關(guān)性及生物學(xué)行為。結(jié)果宮頸鱗癌組織整合素α5β1蛋白和乙酰肝素酶蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為77.9%和72.1%，均高于正常宮頸組織(P<0.05)；整合素α5β1、HPA蛋白均與宮頸鱗癌的分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)深度顯著相關(guān)；整合素α5β1蛋白和乙酰肝素酶蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)性(r=0.594)。 結(jié)論整合素α5β1蛋白和乙酰肝素酶蛋白高表達(dá)與宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，具有正協(xié)同作用，并可作為判斷宮頸鱗癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的預(yù)測(cè)因素。

〔關(guān)鍵詞〕宮頸鱗癌；整合素α5β1；乙酰肝素酶；組織芯片

宮頸鱗癌為女性常見的惡性腫瘤之一，目前臨床90%就診患者均處于進(jìn)展期，即確診時(shí)已發(fā)生不同程度的局部浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移。尋找宮頸鱗癌的早期診斷指標(biāo)和找到特異性作用途徑來(lái)抑制浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移，已經(jīng)成為研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。整合素α5β1 主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附和遷移,能顯著提高腫瘤的轉(zhuǎn)移能力。乙酰肝素酶(HPA)能破壞細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和基底膜(BM)促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移。所以作為細(xì)胞黏附分子的整合素α5β1以及能夠破壞ECM和BM的HPA在腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過程中的作用非常重要〔1〕。目前國(guó)內(nèi)對(duì)宮頸鱗癌組織中整合素α5β1、HPA的相關(guān)性研究未見報(bào)道。本項(xiàng)目采用高通量、多樣本分析的組織芯片技術(shù)結(jié)合免疫組化檢測(cè)的方法檢測(cè)宮頸鱗癌。

1資料與方法

1.1一般資料采集2011年8月至2014年4月，承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、承德醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院及266醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理專家診斷確診為宮頸鱗癌組織68例，正常宮頸組織20例,平均年齡64歲。每例患者術(shù)前均未行各種激素治療及放療、化療。所有病例臨床病理資料完整，標(biāo)本均進(jìn)行連續(xù)切片，片厚5 μm。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑整合素α5β1蛋白和HPA蛋白免疫組化試劑盒(北京Bioss生物技術(shù)有限公司)、0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯示劑。

1.3組織芯片的構(gòu)建將需要的組織在HE切片上標(biāo)出，用組織芯片儀吸針從供體蠟塊取出組織，按照預(yù)先設(shè)計(jì)好的順序排列，裝載在受體蠟塊中，每例組織都可重復(fù)裝載，以保證芯片中組織的代表性，并且可避免組織脫片造成的信息丟失。受體蠟塊制備好后，連續(xù)5 μm切片粘貼于經(jīng)過APES處理過的玻片上。

1.4免疫組化采用免疫組化SP法同步檢測(cè)整合素α5β1和HPA蛋白的表達(dá)情況，一抗為小鼠抗整合素α5β1和HPA抗體。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，由試劑公司提供陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.5結(jié)果判定整合素α5β1蛋白表達(dá)主要分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，而HPA蛋白表達(dá)主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，以出現(xiàn)棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。采用雙評(píng)分半定量法進(jìn)行評(píng)分：靶細(xì)胞的陽(yáng)性率<25%為0分，25%～50%為1分，51%～75%為2分，>75%為3分；染色反應(yīng)的深度計(jì)分為0～3分，其中染色深度以多數(shù)細(xì)胞的呈色反應(yīng)為準(zhǔn)，不著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，深棕黃色為3分。并根據(jù)這兩項(xiàng)的計(jì)分之和分為4級(jí)即：陰性(-)為0分，弱陽(yáng)性(+)為1～2分，陽(yáng)性()為3～4分。強(qiáng)陽(yáng)性()為5～6分。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行χ2檢驗(yàn)、Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

2結(jié)果

2.1整合素α5β1蛋白和HPA蛋白在宮頸鱗癌和正常宮頸組織中的表達(dá)情況宮頸鱗癌組織中整合素α5β1蛋白陽(yáng)性率明顯高于宮頸正常組織(P<0.05)。宮頸鱗癌組織中HPA蛋白的陽(yáng)性率明顯高于宮頸正常組織(P<0.05)。見圖1，圖2，表1。

圖1　宮頸鱗癌及宮頸正常組織整合素α5β1蛋白的表達(dá)(DAB，×200)

圖2　宮頸鱗癌及宮頸正常組織HPA蛋白的表達(dá)(DAB，×200)

組織n染色結(jié)果-+陽(yáng)性率(%)HPA染色結(jié)果-+陽(yáng)性率(%)宮頸鱗癌組織68159172777.91)1911211772.11)癌旁正常組織201730015.01622020

與癌旁正常組織比較：1)P<0.05

2.2宮頸鱗癌組織中整合素α5β1蛋白和HPA蛋白的臨床生物學(xué)行為關(guān)系 整合素α5β1和HPA蛋白在宮頸鱗癌非角化型組的表達(dá)都高于角化型組的表達(dá)，兩組間差異顯著(P<0.05)。臨床分期Ⅲ、Ⅳ期組整合素α5β1蛋白和HPA蛋白的表達(dá)都明顯高于Ⅰ、Ⅱ期組，分期越高表達(dá)越強(qiáng)(P<0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組整合素α5β1蛋白和HPA蛋白的表達(dá)明顯都高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)。浸潤(rùn)深肌層組整合素α5β1蛋白和HPA蛋白的表達(dá)都明顯高于淺肌層組(P<0.05)。見表2。

表2　宮頸癌組織中整合素α5β1 和 HPA臨床生物學(xué)行為關(guān)系〔n(%)〕

2.3宮頸鱗癌組織中整合素α5β1蛋白和HPA蛋白表達(dá)的相關(guān)性68例宮頸鱗癌組織中α5β1蛋白和HPA蛋白表達(dá)強(qiáng)度呈明顯正相關(guān)(r=0.594，P<0.01)，即宮頸鱗癌組織中整合素α5β1表達(dá)愈強(qiáng)，HPA蛋白表達(dá)愈強(qiáng)，反之亦然，即：整合素α5β1和HPA在宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有正協(xié)同作用。見表3。

表3　整合素α5β1蛋白和HPA蛋白在宮頸鱗癌組織中的相關(guān)性(n)

3討論

整合素α5β1是由α5和β1兩亞基結(jié)合而成的異二聚體。整合素α5β1是一類很重要的細(xì)胞表面受體，其配體是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的組成成分之一纖黏連蛋白(FN)，主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過程中都起著重要作用〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)在許多惡性腫瘤組織中均有整合素α5β1的異常表達(dá),整合素α5β1在胃癌〔3〕、肺癌〔4〕、肝癌〔5〕、腸癌〔6〕、膽囊癌〔7〕等腫瘤細(xì)胞中都有表達(dá)。遲福生等〔8〕研究賁門癌組織中整合素α5β1 mRNA的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)賁門癌組織中整合素α5β1 mRNA的表達(dá)明顯高于癌旁正常胃黏膜組織，并且與癌組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分期呈正相關(guān)，與癌組織分化程度呈負(fù)相關(guān)。李桃等〔3〕免疫組化方法檢測(cè)結(jié)果：整合素α5β1在胃癌中的表達(dá)明顯高于正常胃黏膜,這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。整合素α5β1蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)及意義的研究在國(guó)內(nèi)未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用組織芯片技術(shù)結(jié)合免疫組化SP法從蛋白水平上檢測(cè)整合素α5β1蛋白在宮頸鱗癌及正常宮頸組織中的表達(dá)情況,宮頸鱗癌的表達(dá)明顯高于宮頸正常組織，說明整合素α5β1蛋白與宮頸鱗癌發(fā)生有關(guān)。整合素α5β1蛋白與宮頸鱗癌的分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度有密切聯(lián)系，提示整合素α5β1蛋白參與了宮頸鱗癌的發(fā)生及浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過程。

完整的BM可以限制癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，癌細(xì)胞必須突破BM才能向遠(yuǎn)處浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，因此能夠降解ECM及BM的物質(zhì)與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。HPA是迄今為止人體內(nèi)的唯一能夠在特定部位裂解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)的酶，破壞ECM和BM促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移。HPA的正常表達(dá)僅限于胎盤和免疫器官，而在惡性腫瘤細(xì)胞中尤其在高侵襲力惡性腫瘤細(xì)胞中，都有HPA的異常高表達(dá)。蘇寧等〔9〕研究HPA在肝細(xì)胞癌及胃癌中的表達(dá)及其臨床意義，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPA在肝細(xì)胞癌和胃癌中的過表達(dá)。姜維華等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)HPA在胃癌中高表達(dá)，且與腫瘤組織學(xué)分級(jí)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。用組織芯片結(jié)合免疫組化技術(shù)研究宮頸鱗癌未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過組織芯片結(jié)合免疫組化技術(shù)檢測(cè)到HPA在宮頸鱗癌組織中過表達(dá)，和正常宮頸組織相比有明顯的差異，說明HPA在宮頸鱗癌的發(fā)生過程中有著非常重要的作用。HPA蛋白的表達(dá)與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度及臨床分期都有關(guān)，這些也提示我們，HPA蛋白也參與了宮頸鱗癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的過程。

整合素α5β1蛋白和HPA蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)的相關(guān)性未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過組織芯片結(jié)合免疫組化技術(shù)結(jié)果顯示，整合素α5β1、HPA在宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中起著正協(xié)同作用。有理論認(rèn)為〔11〕：可將腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過程主要分成三步：黏附、降解和移動(dòng)。整合素α5β1是一種黏附因子，它的過表達(dá)可以使得腫瘤細(xì)胞與BM、ECM間的黏附增高，而HPA人體內(nèi)的唯一能夠在特定部位裂解HSPG的酶，能夠降解ECM和BM，因此整合素α5β1的黏附作用和HPA的基質(zhì)降解作用在宮頸鱗癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過程中是相互配合共同作用完成。

綜上，通過組織芯片技術(shù)結(jié)合免疫組化同步檢測(cè)整合素α5β1、HPA蛋白在正常宮頸組織和宮頸鱗癌組織中的表達(dá)情況，從而進(jìn)一步說明整合素α5β1、HPA在宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，并且二者起正協(xié)同作用，為探討宮頸鱗癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，以及為宮頸鱗癌的早期診斷提供新線索，并且可以為宮頸鱗癌的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

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〔2014-12-09修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

基金項(xiàng)目：河北省計(jì)生委指令性課題 (2012-A21)

通訊作者：齊潔敏(1966-)，女， 教授， 碩士生導(dǎo)師，主要從事生殖系統(tǒng)腫瘤研究。

〔中圖分類號(hào)〕R737.33

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)13-3131-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.016

第一作者：王闖(1986-)，女，碩士，主要從事生殖系統(tǒng)腫瘤研究。