張紅兵　趙國茂　仇艷光　狄柯坪

(河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院食品質(zhì)量安全研究所，河北　石家莊　050061)

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顯微錄像系統(tǒng)觀察川芎嗪對血瘀證家兔的活血化瘀作用

張紅兵趙國茂1仇艷光2狄柯坪2

(河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院食品質(zhì)量安全研究所，河北石家莊050061)

〔摘要〕目的在活體情況下，用攝錄像系統(tǒng)顯微觀察川芎嗪對實(shí)驗(yàn)性血瘀證家兔腸系膜微血管微循環(huán)的影響。方法采用活體恒溫微循環(huán)灌流結(jié)合顯微錄像電視放大技術(shù)，分別觀測血瘀證前后家兔腸系膜微血管口徑、血流速度、單位面積腸系膜血流量、微血管開放數(shù)量、白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附力變化、血液流動(dòng)狀態(tài)等的改變以及川芎嗪對上述指標(biāo)的影響。結(jié)果川芎嗪可以通過改善血流狀態(tài)、擴(kuò)張血瘀癥時(shí)縮小的微血管管徑，增加微血管的開放數(shù)量，加快微血管內(nèi)血流速度，減少白細(xì)胞黏附和組織液的生成等多種方式，改善局部缺血狀態(tài)增加微循環(huán)灌注。結(jié)論改善腸系膜微循環(huán)、增加血液灌注是川芎嗪發(fā)揮活血化瘀作用的病理基礎(chǔ)。

〔關(guān)鍵詞〕川芎嗪；血瘀證；微循環(huán)

傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為血瘀證對人體危害很大〔1〕。川芎嗪作為活血化瘀藥有很好的療效，但作用機(jī)制仍不明。以往實(shí)驗(yàn)多針對離體標(biāo)本的血液流變學(xué)測量，直觀性差，缺乏活體動(dòng)態(tài)描述。本實(shí)驗(yàn)采用顯微電視錄像靜畫步進(jìn)法，在活體中定量測定川芎嗪對血瘀證前后腸系膜同一支微動(dòng)脈內(nèi)血管內(nèi)徑、血流速度、血流量的影響，觀察同一支微靜脈內(nèi)白細(xì)胞流動(dòng)狀態(tài)的變化，可綜合反映神經(jīng)、體液等整體方面動(dòng)態(tài)，以便更好解釋中藥多層次多靶點(diǎn)發(fā)揮藥效的機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器成年健康雄性大耳白家兔18只，體重2.0～2.5 kg，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供(動(dòng)物證號(hào)：SCXK〔冀〕2008-1-003)，實(shí)驗(yàn)前自由飲水，禁食48 h。川芎嗪注射液(20 mg/ml)由北京第四制藥廠提供，0.9%生理鹽水注射液(河北醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室)。Olympus倒置顯微鏡(CK2型)，JVC攝錄放像機(jī)(HR-D337MS型)，時(shí)間發(fā)生器(VTG-33型)，Nikon四道生理記錄儀(WI-641GC型)，腸系膜固定環(huán)(中國沈陽)，閉路循環(huán)式雙層恒溫微循環(huán)灌流盒(中國航天第606研究所)。

1.2動(dòng)物模型復(fù)制18只實(shí)驗(yàn)家兔隨機(jī)分為對照組、血瘀證模型組和川芎嗪組，每組各6只。采用改良的Rosata法對除對照組外家兔分別在非嚴(yán)格無菌條件下行闌尾切除術(shù)，常規(guī)逐層關(guān)腹，術(shù)后腹腔內(nèi)發(fā)炎，證明血瘀證模型制作成功。分別在術(shù)前30 min、術(shù)后即刻、術(shù)后12 h按照10滴/min的速度靜脈點(diǎn)滴0.9%生理鹽水35 ml，川芎嗪組同時(shí)按0.1 ml/kg補(bǔ)加川芎嗪注射液。12 h后再按原切口打開腹腔，嚴(yán)格按照腸系膜微循環(huán)觀察法，同步觀察并錄制血瘀證后腸系膜微循環(huán)改變及川芎嗪對血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)造成的影響。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,控制室溫為22℃～26℃。

1.3腸系膜微循環(huán)觀察與指標(biāo)測定

1.3.1觀察腸系膜微循環(huán)以25%的烏拉坦(0.75 g/kg)腹腔注射行基礎(chǔ)麻醉，氯醛酮(30 mg/kg)耳緣靜脈注射維持麻醉。氣管插管置家兔于自發(fā)呼吸狀態(tài)。右頸動(dòng)脈插入聚氯乙烯導(dǎo)管,接血壓傳感器,將血壓顯示并記錄。在倒置顯微鏡上放置恒溫微循環(huán)灌流盒，并用37.5℃、pH7.35的Krebs-Ringe液預(yù)先充滿該灌流盒。打開家兔側(cè)腹，將一部分小腸暴露出體外,在距闌尾10 cm左右處選擇有細(xì)小血管走行、脂肪較少的腸系膜放置于灌流盒內(nèi)，選擇沒有大血管的區(qū)域作為固定部位。在呼吸、血壓同步監(jiān)測的情況下，用光學(xué)系統(tǒng)將腸系膜微血管網(wǎng)放大，觀察微循環(huán)狀態(tài)。用排氣法保證焦距的恒定和畫面的穩(wěn)定，保證手術(shù)前后腸系膜微循環(huán)的觀察部位、范圍保持固定。

1.3.2測定微血管內(nèi)徑用電視時(shí)間發(fā)生器將每隔10 ms時(shí)間的畫面疊加到放大550倍的監(jiān)視器畫面上，用連接在倒置顯微鏡上的攝像機(jī)攝取微血管圖像并把該圖像反錄到錄像帶上。用錄放機(jī)播放速度調(diào)節(jié)功能鍵使血管圖像得到重現(xiàn)。在放大550倍的監(jiān)視器再生畫面上,選擇管壁結(jié)構(gòu)清楚的部位,用游標(biāo)卡尺分別測出指定微血管內(nèi)徑，取3次的平均值。

1.3.3觀測微血管內(nèi)白細(xì)胞流態(tài)應(yīng)用顯微錄像靜畫步進(jìn)法，比較每隔10 ms時(shí)間疊加的畫面，檢測在60 s內(nèi)通過選定微血管中央?yún)^(qū)域的每個(gè)白細(xì)胞流動(dòng)狀態(tài)的改變以及此段血管中白細(xì)胞的附壁數(shù)量的變化，根據(jù)Zeintle公式，推算白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間黏附力的改變〔2〕。觀察計(jì)數(shù)整個(gè)視野內(nèi)滲出的白細(xì)胞數(shù)量。

1.3.4測定微血管內(nèi)紅細(xì)胞血流速度與血液灌注量置光敏元件于微血管壁內(nèi)徑處，采用兩點(diǎn)光電法測量微細(xì)動(dòng)脈內(nèi)的紅細(xì)胞移動(dòng)速度。于監(jiān)視器再生畫面中測量紅細(xì)胞每40 ms的移動(dòng)距離，根據(jù)紅細(xì)胞血流速度的快慢，改變數(shù)據(jù)段的長短，依據(jù)血流速度和血流量換算公式，按照預(yù)定的程序進(jìn)行信號(hào)分析，得出紅細(xì)胞的血流速度和血液灌注量。同時(shí)測定手術(shù)部位三支微血管的數(shù)據(jù)取其平均值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用 SPSS18.0 軟件行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1血瘀證發(fā)生后微循環(huán)狀態(tài)的改變血瘀證發(fā)生后微循環(huán)觀測視野變得比較模糊，說明微血管管壁結(jié)構(gòu)遭到破壞，形成散在出血點(diǎn)，可能由于局部組織水腫以及纖維蛋白滲出有關(guān)。微循環(huán)內(nèi)的血流狀態(tài)發(fā)生漸進(jìn)性改變，由最初正常的軸流逐漸改變?yōu)榫€流、線粒流、鐘擺流甚至出現(xiàn)血流停滯現(xiàn)象。模型組10 μm以下腸系膜微動(dòng)脈、微靜脈內(nèi)的血流速度均降低，其中微動(dòng)脈內(nèi)的血流速度僅相當(dāng)于血瘀前的45%，血流量相當(dāng)于血瘀前的48%(見表1)；微靜脈內(nèi)附壁滾動(dòng)和黏附的白細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，白細(xì)胞由軸流進(jìn)入血流的邊流，組織局部滲出的白細(xì)胞數(shù)量增多。觀測視野內(nèi)部分微血管處于關(guān)閉或管徑收縮狀態(tài)，微循環(huán)呈現(xiàn)缺血低灌注狀態(tài)。

表1　川芎嗪對血瘀證前后微循環(huán)的影響±s，n=3)

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

2.2川芎嗪改善血瘀證后微循環(huán)的低灌注狀態(tài)血瘀證發(fā)生后，腸系膜微血管內(nèi)的血液灌注量下降為血瘀前的48%，川芎嗪可使其恢復(fù)到血瘀前73%的水平(見表1)。川芎嗪還可使因血瘀導(dǎo)致縮小的微血管重新舒張，以得到更多的血液灌注，血瘀時(shí)微動(dòng)脈管徑縮小到正常時(shí)的45%，川芎嗪可使其逐步擴(kuò)張，能恢復(fù)到正常值的75%(見圖1)。觀測還發(fā)現(xiàn)，血瘀癥后血流速度明顯減慢，與血瘀證模型組相比，川芎嗪組血流速度明顯加快，能恢復(fù)到正常值的79%左右。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)血瘀證時(shí)白細(xì)胞附壁黏著增強(qiáng)，導(dǎo)致毛細(xì)血管嵌塞，影響血流狀態(tài)。川芎嗪雖然不影響正常動(dòng)物微循環(huán)內(nèi)的白細(xì)胞流態(tài)，但能明顯減少血瘀證時(shí)白細(xì)胞的附壁滾動(dòng)和黏附，改變血流狀態(tài)。

圖1　川芎嗪舒張血瘀證后縮小的微血管(×400)

3討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“血瘀”是血液瘀滯或停滯。血瘀證就是體內(nèi)血液瘀滯于一定處所引起血脈瘀滯不暢，氣滯血瘀所致的各種有關(guān)臨床病證，不僅包括血瘀、氣瘀，也含有“津”(組織液)的瘀積和“液”(淋巴液)的瘀滯，是對循環(huán)代謝障礙一類疾病的病理概括，它與全身和局部微循環(huán)障礙有著密切的關(guān)系，可見如果把血瘀簡單等同于炎癥的看法是非常膚淺的?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為血瘀證是由于血液循環(huán)障礙而造成的全身或局部組織器官供血供氧不足，引起水腫、變性、炎癥、增生、壞死、糜爛、潰瘍、萎縮及血栓、出血等多種病理變化，其本質(zhì)是微循環(huán)障礙及血液流變性異?！?〕。由于氣血津液是維持人體生命活動(dòng)不可缺少的物質(zhì)，所以血瘀證對人體危害甚大。

血瘀證發(fā)生時(shí)導(dǎo)致多種實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)的異常改變，僅憑某一指標(biāo)的變化判斷血瘀證是否形成，很容易導(dǎo)致出現(xiàn)“百病皆有瘀，無病不活血”的傾向，背離了中醫(yī)辨證施治論治的精髓，也悖于臨床實(shí)際〔4〕。因此構(gòu)建符合臨床實(shí)際應(yīng)用的血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)，明確血瘀證的微觀證據(jù)十分重要。

微循環(huán)是微動(dòng)脈與微靜脈之間的微小血液循環(huán)及物質(zhì)交換的場所，直接參與組織和細(xì)胞的物質(zhì)、能量及信息傳遞，參與調(diào)節(jié)血液、淋巴液與組織液流動(dòng)，類似于中醫(yī)“孫絡(luò)”，可運(yùn)行氣血，輸精排濁，如出現(xiàn)病變可導(dǎo)致脈絡(luò)疲痹，氣血不通，臟腑失養(yǎng)。通常血瘀證與微循環(huán)障礙互相伴隨，與中醫(yī)學(xué)“有其內(nèi)，必有其外”的理論一致〔5〕。本實(shí)驗(yàn)選用腸系膜作為檢測對象，經(jīng)過系統(tǒng)把活體腸系膜微血管網(wǎng)放大到400倍，可以清晰地分辨出紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，具有精確度高、直觀性強(qiáng)、再現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)，便于綜合考慮體內(nèi)神經(jīng)、體液、內(nèi)分泌等方面的影響，使微循環(huán)研究步入細(xì)胞水平。這種定量測定可有效彌補(bǔ)定性判斷和主觀目測不足，對明確血瘀證的診斷提供新思路。

川芎嗪是中藥傘形科植物川芎的有效成分，其化學(xué)成分為四甲基吡嗪，目前已能人工合成并廣泛應(yīng)用于臨床心腦血管疾病的治療。它具有擴(kuò)張血管，抑制血小板聚集，降低血小板活性，減少血中丙二醛(MDA)，提高超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)水平，抑制H2O2釋放等多種功能。雖然以往的研究明確了川芎嗪活血化瘀作用的一些分子作用靶點(diǎn)和信號(hào)傳遞通路〔6〕，但由于過分強(qiáng)調(diào)局部的改變，對解釋中藥整體藥效發(fā)揮存在一定不足。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明川芎嗪使原處于收縮狀態(tài)的微血管重新舒張，血瘀證部位微血管口徑增大，血瘀部位白細(xì)胞的游出減少，有利于組織液生成，減輕炎癥反應(yīng)。其原因可能是瘀血激活了白細(xì)胞，使其與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附性增強(qiáng)；川芎嗪減少了白細(xì)胞游出、降低了其生物活性，減弱了它與血管內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附力。川芎嗪加快微血管內(nèi)血流速度，改善血流狀態(tài)，的作用機(jī)制究竟是由于川芎嗪增加了紅細(xì)胞變形性使血液黏度降低，還是因?yàn)檠“?、白?xì)胞狀態(tài)改變導(dǎo)致，還是兩者兼有？川芎嗪可以通過作用于毛細(xì)血管前括約肌，使原處于關(guān)閉或收縮狀態(tài)的微血管重新舒張，增加了腸系膜內(nèi)微血管的開放數(shù)量，其機(jī)制與內(nèi)分泌因素、第二信使的作用有關(guān)，但對于川芎嗪是通過內(nèi)源性一氧化氮(NO)介導(dǎo)的，還是本身起到外源性NO的作用，也存在爭議〔7,8〕。

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〔2014-12-03修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

基金項(xiàng)目：河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(11231005D-5)；河北省中醫(yī)藥管理局指令性計(jì)劃(No.2008082)；河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)校內(nèi)科研項(xiàng)目(2015KYZ01)

通訊作者：狄柯坪(1971-)，女，博士，副教授，主要從事中草藥作用機(jī)制研究。

〔中圖分類號(hào)〕R285.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)13-3126-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.014

1解放軍第196旅醫(yī)院2解放軍白求恩醫(yī)務(wù)士官學(xué)校

第一作者：張紅兵(1966-)，女，博士，碩士生導(dǎo)師，副教授，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。