劉金濤　陳　葉　金　燕　黃海燕　孟　琮　何建成

(上海中醫(yī)藥大學(xué)，上?！?01203)

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綠茶對1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶致帕金森病小鼠模型神經(jīng)行為學(xué)的防治作用

劉金濤陳葉金燕黃海燕孟琮何建成

(上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海201203)

〔摘要〕目的觀察綠茶對1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)所致帕金森病(PD)小鼠的防治作用。方法C57BL/6小鼠腹腔注射MPTP 30 mg·kg-1·d-1，連續(xù)4 d，制備PD模型，并隨機分為5組：模型組、綠茶多酚組(GTP)、綠茶低(L)、中(M)、高(H)劑量組，另取正常組作對照。GTP組灌胃GTP 0.625 g·kg-1·d-1，綠茶L、M、H劑量組灌胃0.312、0.625、1.250 g·kg-1·d-1，正常組和模型組灌胃生理鹽水10 ml·kg-1·d-1，連續(xù)14 d。于灌胃第8天起，GTP組、綠茶各劑量組和模型組小鼠腹腔注射MPTP 30 mg/kg，連續(xù)4 d。模型組、GTP組和綠茶L、M、H劑量組于第11天腹腔注射MPTP后，進(jìn)行震顫麻痹評分實驗,各組于第15天進(jìn)行小鼠肢體運動功能(爬桿、游泳)檢測。結(jié)果綠茶對小鼠肢體運動功能的減退有不同程度的調(diào)節(jié)和改善作用。結(jié)論綠茶L、M、H劑量組對改善PD小鼠行為學(xué)異常均有一定的效果，效果等同于甚至優(yōu)于GTP，且綠茶H組(1.250 g·kg-1·d-1)效果最好。可推算出體重60 kg的普通居民每日通過飲用3.03、6.08和12.15 g綠茶對防治PD有一定效果。

〔關(guān)鍵詞〕綠茶；綠茶多酚(GTP)；帕金森病；1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶；神經(jīng)行為學(xué)

帕金森病 (PD)是以震顫、肌肉強直、運動減少和姿勢異常為特征的慢性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病〔1〕。綠茶多酚(GTP)對偏側(cè)PD大鼠模型的多巴胺神經(jīng)元損傷有明顯保護作用〔2〕。此外，茶葉中還含有咖啡因和茶氨酸等將近450種成分。而已有的研究也證明咖啡因和茶氨酸對PD也有作用〔3，4〕。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，飲茶可降低PD等神經(jīng)變性病的發(fā)病風(fēng)險〔5～7〕。本研究比較綠茶和GTP對1-甲基4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)所致的PDC57BL/6小鼠的防治效果，同時探討普通居民通過飲用綠茶防治PD所用綠茶的適宜劑量。

1材料與儀器

1.1動物健康5周齡C57BL/6小鼠，78只，SPF級，雄性，體重(20±2)g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。許可證號：SCXK(滬)2008-0016。實驗條件：動物飼養(yǎng)在上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，恒溫(20±2)℃，自動光-暗控制(LD12∶12 ,即07∶00 - 19∶00 光照,19：00～07∶00 暗置)，相對濕度60%～65%,動物攝食飲水自由。

1.2藥品、試劑與儀器1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)：購自Sigma公司，生產(chǎn)批號1001265783；西湖龍井； GTP：購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司。爬桿：自制直徑18 cm，高60 cm的直木桿,桿頂部有一小木球,外面覆蓋紗布以防止小鼠打滑；有機玻璃水箱：20 cm×30 cm×20 cm。

1.3MPTP溶液的制備將382.5 mg MPTP溶于382.5 ml無菌生理鹽水，配成濃度為0.001 g/ml的溶液。

1.4綠茶水提物溶液的制備500 g綠茶，加水9 L，浸泡45 min，大火煮沸，保持微沸狀態(tài)45 min，趁熱過濾，藥渣加水9 L，繼續(xù)煮沸，保持微沸45 min，趁熱過濾，合并藥液，對上述藥液進(jìn)行減壓濃縮，保持水浴鍋溫度90℃左右，濃縮至生藥濃度為1 g生藥/ml，停止，將提取物取出放在烘箱烘干，綠茶溶液配制方法為將干燥綠茶水提物溶于蒸餾水中，配成0.031 25、0.062 5和0.125 g/ml 3個不同濃度的溶液。

1.5GTP溶液的制備將21 g綠茶多酚溶于336 ml蒸餾水中，制成0.062 5 g/ml的GTP溶液。

1.6小鼠模型制備〔8〕將MPTP溶液按30 mg/kg的劑量給予小鼠腹腔注射，1次/d，連續(xù)4 d。

1.7動物分組及給藥

1.7.1動物分組動物適應(yīng)環(huán)境1 w后，將78只小鼠隨機分為正常組、模型組、GTP組、綠茶L、M和H劑量組，每組13只。實驗過程中4例小鼠死亡，共取得74例樣本。

1.7.2動物給藥呂俊華等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)給予小鼠0.625 g·kg-1·d-1綠茶多酚灌胃可有效改善對D-半乳糖與Aβ25～35誘導(dǎo)的AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。本研究采用此劑量作為GTP組和綠茶M組給藥量，0.312、1.250 g·kg-1·d-1分別作為綠茶L、H劑量組給藥量。GTP組灌胃GTP 0.625 g·kg-1·d-1，綠茶L、M和H劑量組灌胃綠茶溶液0.312、0.625、1.250 g·kg-1·d-1，正常組和模型組灌胃生理鹽水10 ml·kg-1·d-1，連續(xù)14 d。于灌胃第8天起，GTP組、綠茶各劑量組和模型組腹腔注射MPTP 30 mg/kg，連續(xù)4 d。模型組、GTP組和綠茶L、M和H劑量組于第11天腹腔注射MPTP后，進(jìn)行震顫麻痹評分實驗；各組于第15天進(jìn)行肢體運動功能(爬桿、游泳)檢測。

1.8 觀察指標(biāo)及測試方法

1.8.1震顫麻痹評分〔10〕于第11天腹腔注射MPTP后立即觀察C57BL/6小鼠的行為變化，記錄小鼠震顫麻痹潛伏期(從腹腔注射完畢開始到出現(xiàn)震顫麻痹癥狀為止)、持續(xù)期(從出現(xiàn)震顫麻痹癥狀開始到癥狀完全消失)時間，按評分表在持續(xù)期進(jìn)行評分。分值越高，震顫麻痹癥狀越嚴(yán)重，同時注意震顫麻痹的潛伏期和維持期，并作統(tǒng)計學(xué)分析。

1.8.2爬桿實驗于第15天進(jìn)行爬桿實驗，根據(jù)Ogawa等〔11〕的測試方法進(jìn)行改進(jìn),用爬桿測定桿測定小鼠爬完桿所需要的時間。方法為將小鼠頭向下放于桿頂端,記錄它們下到桿底的時間，每次測試間隔1 min,共測試5次，取平均值。

1.8.3游泳實驗于第15天進(jìn)行游泳實驗，根據(jù)Donnan等〔12〕的測試方法,對小鼠游泳能力進(jìn)行評分。方法為將受試小鼠放入一個20 cm×30 cm×20 cm規(guī)格的有機玻璃水箱中,水深10 cm,水溫為22℃～25℃。每次測試間隔1 min,共測試5次取平均值。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS15.0軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1小鼠行為表現(xiàn)給予MPTP后所有小鼠先出現(xiàn)短暫興奮，后表現(xiàn)為全身震顫、豎毛、尾僵直、對外界刺激反應(yīng)低下等。持續(xù)2 h后，上述癥狀逐漸減輕。正常組動物在注射生理鹽水前后，其行為表現(xiàn)無差異。

2.2綠茶對MPTP致PD小鼠潛伏期、持續(xù)期和持續(xù)期評分的影響與模型組比較，各給藥組潛伏期明顯延長(P<0.05，P<0.01)；各給藥組持續(xù)期顯著降低(P<0.01)；各給藥組持續(xù)期評分降低(P<0.05，P<0.01)。見表1。

2.3綠茶對PTP致PD小鼠爬桿行為和游泳評分的影響與模型組比較，給藥組爬桿時間顯著縮短(P<0.05，P<0.01)；GTP組、綠茶H組游泳評分升高(P<0.05)。見表2。

表1　各組小鼠潛伏期、持續(xù)期和持續(xù)期震顫麻痹評分比較

與模型組比較:1)P<0.05，2)P<0.01，下表同

表2　各組小鼠爬桿行為和游泳評分比較±s)

3討論

PD的病因和發(fā)病機制還不明確，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是PD的主要致病機制〔13〕?；钚匝?、一氧化氮等，在單個發(fā)生的PD致病機制中起著重要作用〔14〕。茶多酚作為一個很好的抗氧化劑，應(yīng)具有消除這些病理機制的潛在能力。研究同時表明GTP對偏側(cè)PD大鼠模型的多巴胺神經(jīng)元損傷有保護作用，其機制可能是抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)〔2〕。GTP含量約占茶葉干重的20%～30%，除GTP之外，綠茶還含有茶多糖、咖啡堿、茶氨酸等活性成分〔15〕?？Х纫蚝湍峁哦≡赑D的動物模型實驗中表明能預(yù)防神經(jīng)毒性誘導(dǎo)的黑質(zhì)中神經(jīng)細(xì)胞的破壞和紋狀體多巴胺的減少，在生物體中具有類似的生物學(xué)機制〔3〕。由于茶氨酸是興奮性遞質(zhì)谷氨酸的類似物，因此提示茶氨酸的神經(jīng)保護作用可能是與谷氨酸競爭了谷氨酸受體，從而抑制谷氨酸的興奮毒性而起到神經(jīng)保護的作用〔4〕。茶葉的神經(jīng)保護作用可能與茶多酚和茶氨酸等有關(guān)〔16〕。MPTP給C57BL/6小鼠腹腔注射制備PD模型是公認(rèn)的較為理想的PD模型。本實驗結(jié)果證明，綠茶L、M、H劑量組對改善小鼠行為學(xué)異常均有一定的效果，效果等同于甚至優(yōu)于GTP，且綠茶高劑量組(1.250 g·kg-1·d-1)效果最好。按照本研究結(jié)果，小鼠每日飲用綠茶0.312、0.625和1.250 g/kg均可以對防治PD有一定療效，根據(jù)文獻(xiàn)〔17〕公式的數(shù)據(jù)換算可以得出，體重60 kg的普通居民每日通過飲用3.03 g、6.08 g和12.15 g綠茶對防治PD有一定效果，其中以12.15 g綠茶效果為好。臨床具體應(yīng)用時，可結(jié)合居民的體質(zhì)情況予以選擇。

4參考文獻(xiàn)

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〔2014-12-31修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目(81573899)；國家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金項目資助(J1103607)

通訊作者：何建成(1966-)，男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事中西藥防治心腦血管疾病研究。

〔中圖分類號〕R742.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)13-3119-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.011

Effect of the green tea on the neuroethology of the Parkinson's disease mice caused by MPTP

LIU Jin-Tao,CHEN Ye,JIN Yan,et al.

Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China

【Abstract】ObjectiveTo observe the preventive and cure effects of the green tea on the Parkinson's disease (PD) mice caused by the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-four hydrogen pyridine(MPTP). MethodsNinety mouse were divided into six groups: normal,model,green tea polyphenols (GTP),low,medium and high dose green tea groups. The mice of model group had the intraperitoneal injection of MPTP 30 mg·kg-1·d-1for four days to make PD models. The mice of the GTP group were gavaged by GTP0.625 g·kg-1·d-1. The mice of the low,medium and high dose green tea groups were respectively gavaged by 0.312，0.625，1.250 g·kg-1·d-1for fourteen days. The movement function of the mice were detected by tremors attack rating experiment,climb rod experiment and swimming test. ResultsThe green tea could adjust and improve the mice with the decrease of the leg's movement in different degree. ConclusionsLow,medium and high dose green tea group could improve behavioral abnormalities in mice,the effect was the same as or even better than that of the GTP,and the effects of high dose green tea were best. 60 kg weight ordinary residents drinking 3.03 g,6.08 g and 12.15 g of green tea daily have a certain effect on the prevention and treatment of PD.

【Key words】Green tea;Green tea polyphenols;Parkinson's disease;1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-four hydrogen pyridine (MPTP);Neuroethology

第一作者：劉金濤(1986-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)臨床研究。