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(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨外科，廣東　廣州　510260)

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雌激素缺乏條件下MiR-133通過調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化參與骨質(zhì)疏松形成的機(jī)制

謝楚海史群偉郭劍鴻范子文李菊根陳斌偉曹燕明吳波以

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨外科，廣東廣州510260)

〔摘要〕目的探究MiR-133在雌激素缺乏條件下在骨質(zhì)疏松中的表達(dá)情況及對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響。方法從絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者處分離間充質(zhì)干細(xì)胞，利用qRT-PCR檢測(cè)MiR-133的mRNA表達(dá)水平；利用熒光素酶和Western印跡檢測(cè)MiR-133對(duì)其靶基因SLC39A1表達(dá)的調(diào)控；通過檢測(cè)堿性磷酸酶和RUNX2表達(dá)情況，顯示MiR-133和SLC39A1對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化產(chǎn)生的影響。結(jié)果MiR-133在雌激素缺乏的患者中顯著升高，并且負(fù)性調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力；MiR-133直接靶向負(fù)性調(diào)控SLC39A1啟動(dòng)子活性，降低SLC39A1的蛋白表達(dá)水平；SLC39A1能夠上調(diào)堿性磷酸酶的活性，上調(diào)RUNX2的表達(dá)水平。結(jié)論MiR-133的過表達(dá)與雌激素缺乏具有顯著相關(guān)性，MiR-133通過抑制SLC39A1的表達(dá)弱化間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力，進(jìn)而促使絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

〔關(guān)鍵詞〕MicroRNAs；間充質(zhì)干細(xì)胞；雌激素缺乏；骨質(zhì)疏松

絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松作為一種常見的骨科疾病，主要發(fā)病機(jī)制在于成骨細(xì)胞的骨重建和破骨細(xì)胞的骨吸收之間的平衡遭到了破壞〔1〕。骨吸收增多和骨重建不足與雌激素缺乏具有密切的相關(guān)性〔2，3〕。然而，對(duì)于雌激素缺乏在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松中起到的具體機(jī)制現(xiàn)在還沒有明確報(bào)道。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是骨形成的重要來源。雌激素受體的缺乏可以對(duì)MSCs的分化產(chǎn)生影響〔4，5〕。但是，雌激素缺乏是如何調(diào)控MSCs向成骨細(xì)胞分化的機(jī)制尚處于未知領(lǐng)域。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，miRNAs可能參與了間MSCs的分化過程，如miR-20增強(qiáng)了MSCs的成骨分化能力，而miR-141則具有相反的功能〔6～9〕。也存在幾種miRNAs，如 miR-503發(fā)生能夠異常調(diào)控在絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松〔10〕，但是，其在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松中的主要發(fā)生機(jī)制依舊沒有一個(gè)清楚的解釋結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)闡明MiR-133在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者中的表達(dá)，并且直接靶向SLC39A1，從而弱化MSCs的成骨分化能力。

1材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)由本實(shí)驗(yàn)室保存，DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清購(gòu)自以色列Biolnd公司；胰蛋白酶購(gòu)自研科生物公司；一抗及二抗購(gòu)自武漢三鷹公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自Costar公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce Chemical公司，5倍SDS蛋白上樣緩沖液、SDS、Tris、甘氨酸、TEMED、30%Acr-Bis(29∶1)、Glycine、Tween20、過硫酸銨、脫脂奶粉購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；D-Hank緩沖液為自行配制。

1.2儀器倒置顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Forma公司；-80℃冰箱為中國(guó)海爾集團(tuán)產(chǎn)品；板式酶標(biāo)儀購(gòu)自北京市新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司；電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；單光子儀。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)將從絕經(jīng)患者體內(nèi)獲取的hMSC用含有15%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。用含0.02%EDTA 的0.25%胰酶消化液消化細(xì)胞，并進(jìn)行傳代，傳至4、5代左右，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、增殖旺盛的細(xì)胞用于試驗(yàn)研究。

1.3.2建立穩(wěn)定干擾MiR-133的細(xì)胞系取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)。在六孔板中種入生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到50%～60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分3組：(1)hMSC細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng)，不做任何處理；(2)anti-MiR-NC/hMSC細(xì)胞：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染插入空載質(zhì)粒；(3)干擾MiR-133的hMSC細(xì)胞(anti-MiR-133)：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染插MiR-133目標(biāo)片段5′-GAAGTTTTATTCACATGCT-3′和 5′-CATCAGCTCTGATTCTGTG-3′。同時(shí)用脂質(zhì)體2000進(jìn)行平行轉(zhuǎn)染，6 h以后換液，用G418進(jìn)行篩選，利用Western印跡進(jìn)行鑒定。

1.3.3MiR-133 SLC39A1 mRNA表達(dá)的檢測(cè)首先用TRIzol提取細(xì)胞總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)條件：42℃ 60 min，70℃ 10 min。以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物cDNA 為模板，使用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)SLC39A1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。內(nèi)參照為GAPDH。各引物序列：SLC39A1正向序列 5′-GTCACCTCTGGAGGAAACAAG-3′ 和反向序列5′-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG-3′；GAPDH 正向序列5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′和反向序列5′-TCTAGACGGCAGGTCAGGTC-3′。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 30 s，共39個(gè)循環(huán)。溶解曲線條件：95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃15 s。根據(jù)反應(yīng)結(jié)束后的Ct值(每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù))，通過2-△△Ct法計(jì)算樣品中多種mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，所得產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

1.3.4熒光素酶活性檢測(cè)將hMSC細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～85%融合度時(shí)，共轉(zhuǎn)染熒光素酶報(bào)告載體及negative control mimics，anti-MiR-NC和anti-MiR-133。以轉(zhuǎn)染pRL-TK作為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)質(zhì)控。轉(zhuǎn)染48 h后，收獲細(xì)胞。按Promega公司雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性：棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS清洗3次，然后每孔加入已稀釋的1×PLB裂解細(xì)胞10 min。將細(xì)胞刮下，收集至1.5 ml EP管中，12 000 r/min離心3 min，取上清。取25 μl上清，加入熒光素酶檢測(cè)試劑LARll 100 μl，記錄螢火蟲熒光素酶活性值；然后加入stop&Glo試劑100 μl，記錄海腎熒光素酶活性值。計(jì)算相對(duì)熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.3.5成骨分化相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)采用Western印跡法。

1.3.5.1蛋白樣品的獲得(1)蛋白裂解液的配制(100 μl體系)：100×蛋白酶抑制劑1 μl;蛋白裂解液加至100 μl。(2)蛋白抽提：用預(yù)冷的D-Hank液清洗3次，每一個(gè)孔加入蛋白裂解液，將其置于冰上裂解30 min，用細(xì)胞刮刀將孔中細(xì)胞小心刮下并收集到1.5 ml EP管中，在4℃ 離心機(jī)中以12 000 r/min的速度離30 min，離心完畢后將其取出置于冰上，分裝備用。

1.3.5.2BCA法蛋白定量采用Pierce公司的BCA Protein Assay Reagent Kit進(jìn)行。

1.3.5.3蛋白變性按比例加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，置于金屬浴中95℃孵育10 min后立即置于冰上冷卻，最后放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5.4Western印跡分析(1)電泳：根據(jù)待檢測(cè)蛋白質(zhì)的大小選擇合適濃度的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每泳道上樣40 μg，先70 V電泳30 min，再130 V電泳至溴酚藍(lán)染料跑出膠后停止電泳，冰上進(jìn)行。(2)轉(zhuǎn)膜。(3)封閉：5%脫脂牛奶，用TBST稀釋，室溫封閉1 h。(4)一抗孵育：按照抗體說明書用TBST將一抗稀釋到適合的比例。 (5)洗膜：將PVDF膜轉(zhuǎn)入洗膜盒中，置于搖床上上下洗滌3次，每次10 min。(6)二抗孵育：根據(jù)實(shí)驗(yàn)所用一抗的種屬選擇對(duì)應(yīng)的二抗，并用TBST將二抗稀釋到適合的比例，并將其置于搖床上室溫孵育1 h。(7)洗膜：將PVDF膜轉(zhuǎn)入洗膜盒中，加入適量的TBST液體，置于搖床上上下洗滌3次，每次10 min。(8)顯影：在膜表面滴入適量的HRP化學(xué)顯影液，使之覆蓋膜的整個(gè)表面，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照保存。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0軟件行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1hMSC中MiR-133的表達(dá)情況絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者的hMSC中MiR-133 mRNA的表達(dá)水平(3.09±0.79)比對(duì)照組(1.57±0.67)異常升高(P<0.05)。

2.2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干擾抑制MiR-133的hMSC細(xì)胞系的鑒定通過實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)mRNA水平上，干擾效率達(dá)到80%以上，結(jié)果可信。正常未處理組、miR-NC組、anti-miR-133組分別為1.2±0.45,1.17±0.34，0.25±0.79。

2.3熒光素報(bào)告分析結(jié)果通過在線靶基因軟件預(yù)測(cè)，MiR-133可能與SLC39A1 mRNA的3′-UTR片段4 834～4 840 bp相結(jié)合，且該結(jié)合位點(diǎn)在多物種間高度保守。構(gòu)建報(bào)告載體后，通過熒光素活性檢測(cè)，結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染NC組相比較，MiR-133能夠明顯抑制pSLC39A1-Mt報(bào)告載體的熒光素酶活性(P<0.05)，但是對(duì)突變型的pSLC39A1-Mut無明顯抑制作用；而轉(zhuǎn)染anti-MiR-133能夠明顯恢復(fù)pSLC39A1-Mt報(bào)告載體的活性；表明miR-133特異性與SLC39A1 mRNA的3′-UTR結(jié)合。見圖1。

與NC組比較：1)P<0.05圖1　miR-133對(duì)SLC39A1 mRNA 3′-UTR的調(diào)控情況

2.4利用已經(jīng)鑒定成功構(gòu)建的anti-MiR-133 hMSC細(xì)胞系進(jìn)行恢復(fù)實(shí)驗(yàn)當(dāng)MiR-133過表達(dá)時(shí)SLC39A1和成骨分化的標(biāo)志分子RUNX2的mRNA都發(fā)生顯著下降(P<0.05)，轉(zhuǎn)入anti-MiR-133 inhibitionor細(xì)胞和干擾細(xì)胞系中SLC39A1和RUNX2的mRNA水平有所恢復(fù)，與正常hMCSs沒有明顯差異。見圖2。

2.5利用已經(jīng)成功構(gòu)建的anti-MiR-133 hMSC細(xì)胞系進(jìn)行恢復(fù)實(shí)驗(yàn)當(dāng)MiR-133過表達(dá)時(shí)，SLC39A1和成骨分化的標(biāo)志分子RUNX2的蛋白表達(dá)水平(0.75±0.25，0.68±0.35)都發(fā)生顯著下降(miR-NC組分別為1.17±0.34，1.27±0.14，P<0.05)，轉(zhuǎn)入anti-MiR-133 inhibitionor細(xì)胞和干擾細(xì)胞系中SLC39A1和RUNX2的mRNA水平(1.25±0.79，1.15±0.29)有所恢復(fù)，與正常未處理組hMSCs(1.2±0.45，1.13±0.35)沒有明顯差異，見圖3。

A：正常未處理組；B：MiR-133組;C:anti-MiR-133組;D:anti-MiR-133 inhibitor組；1)P<0.05圖2　miR-133影響SLC39A1和RUNX2的mRNA表達(dá)水平

圖3　miR-133的變化對(duì)SLC39A1和RUNX2蛋白水平的影響

3討論

絕經(jīng)后婦女非常容易患骨質(zhì)疏松，在一定程度上是由于雌激素缺乏引起過度的骨吸收和骨形成不足〔11，12〕。然而，缺乏雌激素在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的確切作用不太明顯。hMSCs具有分化為成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的能力，在骨代謝方面具有重要作用?，F(xiàn)有報(bào)道證明減少hMSCs分化為成骨細(xì)胞可能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松〔13〕。最近的一些研究表示，在雌激素缺乏的情況下，microrNA會(huì)發(fā)生表達(dá)水平的異常性變化，而這些異常性變化可能會(huì)對(duì)參與成骨分化的hMSCs產(chǎn)生影響〔14，15〕。事實(shí)上，microRNA可以抑制或促進(jìn)hMSCs成骨細(xì)胞的分化〔16〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，MiR-133在雌激素缺乏介導(dǎo)的骨質(zhì)疏松患者體內(nèi)處于一種高表達(dá)狀態(tài)，提示我們，MiR-133在雌激素缺乏的骨質(zhì)疏松中可能是作為一種癌基因在行使功能。我們進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)，MiR-133的沉默能夠明顯提高h(yuǎn)MSCs成骨分化能力。通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MiR-133特異性與SLC39A1 mRNA的3′-UTR結(jié)合，從而降低SLC39A1的轉(zhuǎn)錄活性，并且MiR-133能夠降低SLC39A1 mRNA表達(dá)水平，而且沉默MiR-133后SLC39A1和RUNX2表達(dá)升高，說明成骨分化進(jìn)一步發(fā)生和加強(qiáng)。

綜上，雌激素缺乏介導(dǎo)的骨質(zhì)疏松與Mir-133過表達(dá)有關(guān)。MiR-133可以通過削弱成骨分化誘導(dǎo)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生，至少部分是通過抑制SLC39A1表達(dá)，進(jìn)一步抑制hMSCs成骨分化的發(fā)生，從而為雌激素缺乏介導(dǎo)的骨質(zhì)疏松的診治提供新的思路，有望成為雌激素缺乏介導(dǎo)的骨質(zhì)疏松治療的新靶點(diǎn)。

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〔2015-12-06修回〕

(編輯李相軍)

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81574002)；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(S2012010009190)

〔中圖分類號(hào)〕R605

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)13-3105-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.006

MiR-133 is involved in estrogen deficiency induced osteoporosis by modulating osteogenic differentiation of mesenchymal stem cell

XIE Chu-Hai, SHI Qun-Wei, GUO Jian-Hong, et al.

Department of Orthopedics,the Second Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University, Guangzhou 510260,Guangdong,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationships among MiR-133 (estrogen deficiency induced osteoporosis and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells).MethodsThe osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells ability of miR-133 on hMSC cells was detected by qRT-PCR. The binding between miR-133 and predicted target SLC39A1 were verified by dual luciferase assay and Western blot analysis. RUNX2 related proteins were detected using Western blot. ResultsmiR-133 expression was significantly enhanced as a result of estrogen deficiency. Its overexpression was negatively correlated to osteogenic differentiation of hMSCs. SLC39A1 showed an inverse expression trend to miR-133 during the differentiation. Western blot test showed osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells related proteins RUNX2 were obvious changed. ConclusionsmiR-133 overexpression is associated with estrogen deficiency. MiR-133 could induce postmenopausal osteoporosis by weakening osteogenic differentiation of hMSCs, at least partly through repressing SLC39A1 expression.

【Key words】MicroRNAs; Mesenchymal stromal cells; Estrogen deficiency; Osteoporosis

第一作者：謝楚海(1978-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事骨折及老年骨質(zhì)疏松研究。