陳安平　向文雯　夏　燕　馮　佳　楊年安　袁　林　徐　建　向　陽(yáng)

(湖北民族學(xué)院風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北　恩施　445000)

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補(bǔ)體C3f去精氨酸片段對(duì)系統(tǒng)性硬化癥小鼠皮膚纖維化模型構(gòu)建及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1表達(dá)的影響

陳安平向文雯1夏燕馮佳楊年安袁林徐建2向陽(yáng)

(湖北民族學(xué)院風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北恩施445000)

〔摘要〕目的探討補(bǔ)體C3f去精氨酸片段(DRC3f)對(duì)于系統(tǒng)性硬化癥(SSc)小鼠皮膚纖維化模型構(gòu)建和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1表達(dá)的影響。方法采用DRC3f聯(lián)合博來(lái)霉素皮下注射的方法構(gòu)建SSc小鼠模型，并用纖維染色和免疫組化方法比較聯(lián)合與不聯(lián)合DRC3f對(duì)SSc小鼠皮膚纖維化、皮膚增厚程度和TGF-β1表達(dá)的影響。結(jié)果聯(lián)合DRC3f和博來(lái)霉素注射組與單用博來(lái)霉素和博來(lái)霉素聯(lián)合無(wú)關(guān)多肽組比較，皮膚纖維化程度更加明顯，TGF-β1的表達(dá)也明顯增多(P<0.05)。結(jié)論DRC3f能夠促進(jìn)SSc模型小鼠皮膚纖維化和炎癥因子TGF-β1的表達(dá)。

〔關(guān)鍵詞〕補(bǔ)體C3f去精氨酸片段；系統(tǒng)性硬化癥；皮膚纖維化；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1

系統(tǒng)性硬化癥(SSc)的血管損害機(jī)制迄今未明，補(bǔ)體C3片段(C3f)和去精氨酸C3f(DRC3f)是補(bǔ)體活化過(guò)程中C3b失活產(chǎn)生的多肽片段，前期研究顯示，它們?cè)谡T導(dǎo)SSc的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖中起重要作用。本研究進(jìn)一步運(yùn)用DRC3f聯(lián)合博來(lái)霉素(Blm)注射，觀察其對(duì)模型小鼠皮膚纖維化和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1動(dòng)物來(lái)源及試劑BALB/c小鼠購(gòu)自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，清潔級(jí)，雌性6周齡，體重17～20 g。飼養(yǎng)于湖北民族學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。鹽酸Blm購(gòu)自日本化藥株式會(huì)社(批號(hào)：820232)。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司。兔抗鼠TGF-β1(sc7784)多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑PV-9001購(gòu)自中杉金橋生物制品科技有限責(zé)任公司。

1.2方法

1.2.1Blm皮下注射鹽酸Blm以0.01 mmol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解成200 μg/ml。將BALB/c小鼠隨機(jī)分為四組，每組10只，均剃去背部中央?yún)^(qū)被毛。A組以4.5號(hào)無(wú)菌注射針在該部位皮下注射100 μl PBS，B組注射200 μg/ml Blm 100 μl、C組注射Blm+DRC3f各100 μl(Blm為200 μg/ml、DRC3f為5 μg/ml)、D組注射Blm+無(wú)關(guān)多肽纖維蛋白肽A(FPA)各100 μl(Blm為200 μg/ml、FPA為5 μg/ml)。

1.2.2蘇木素-伊紅(HE)染色和纖維染色按操作常規(guī)制備皮膚組織切片和肺組織切片，行HE 染色，觀察皮膚和肺組織學(xué)改變，應(yīng)用醫(yī)學(xué)彩色病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)定真皮厚度，每張切片隨機(jī)取5 處測(cè)皮膚厚度，求得其均值。觀察各組小鼠皮膚厚度的差異。各組小鼠皮膚組織切片加作纖維染色。染色結(jié)果：膠原纖維呈亮綠色，肌纖維呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)褐色。

1.2.3免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組小鼠皮膚組織中靶向沉默誘騙受體3(DcR3)的表達(dá)(1)小鼠皮膚標(biāo)本常規(guī)石蠟切片，厚為4 μm，脫蠟至水；(2)37℃過(guò)夜烤干；(3)2%H2O2去過(guò)氧化物酶5 min，PBS洗3次，5 min/次；(4)5%胎牛血清(BSA)封閉1 h；(5)加入一抗4℃過(guò)夜；(6)取出平衡至室溫1 h；(7)Tris鹽酸緩沖液(TBS)洗3次，每次5 min；(8)加入稀釋好的二抗(1∶500)37℃ 30 min；(9)TBS洗3次，每次5 min；(10)3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)染色終止復(fù)染；(11)同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，以PBS代替一抗，其余步驟不變。

1.2.4染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)用細(xì)胞免疫組織化學(xué)定量分析系統(tǒng)測(cè)定化學(xué)染色皮膚組織切片圖像(×10)，每張切片隨機(jī)取3 個(gè)視野，每個(gè)視野大小為8 500 μm2，以亮綠色(膠原纖維)為陽(yáng)性，計(jì)算每一視野中陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度，并測(cè)定其表達(dá)的陽(yáng)性面積，然后計(jì)算平均值。再計(jì)算每份標(biāo)本的膠原纖維組織化學(xué)指數(shù)。在免疫組織化學(xué)染色的皮膚組織，凡胞質(zhì)或基質(zhì)中出現(xiàn)明顯的棕黃色至黃粉色顆粒者為陽(yáng)性。用細(xì)胞免疫組織化學(xué)定量分析系統(tǒng)(Version 2.0)采集免疫組織化學(xué)染色皮膚組織切片圖像，每張切片隨機(jī)取3 個(gè)視野，每個(gè)視野為8 500 μm2，以棕黃色為陽(yáng)性，計(jì)算每一視野中TGF-β1免疫組織化學(xué)陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度，并測(cè)定其表達(dá)的陽(yáng)性面積，然后計(jì)算平均值。計(jì)算每只小鼠的免疫組織化學(xué)指數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS10.0軟件行χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1皮膚組織病理學(xué)改變B、C、D組小鼠皮膚組織學(xué)均顯示真皮層明顯增厚，膠原纖維明顯增生，均質(zhì)化。 其中C組更加明顯地顯示真皮小血管周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)，血管壁明顯增厚，管腔變小或閉塞；皮膚附屬器明顯減少。而A組小鼠皮膚未出現(xiàn)上述改變。B、C、D組小鼠注射2 w后除出現(xiàn)局部皮膚增厚外，尚出現(xiàn)淺潰瘍、毛發(fā)脫落，且逐日加重。

2.2各組小鼠皮膚厚度及纖維染色指數(shù)的比較見(jiàn)表1，圖1、圖2。

表1　各組小鼠皮膚厚度和纖維染色指數(shù)比較±s,n=10)

與A組比較：1)P<0.01；與B組、D組比較：2)P<0.05

2.3肺組織病理學(xué)改變B、C、D組小鼠肺組織出現(xiàn)肺泡間隔增厚伴大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)，間隙內(nèi)有少量成纖維細(xì)胞增生，小血管壁增厚。A組小鼠未出現(xiàn)上述改變，見(jiàn)圖3。

2.4各組小鼠皮膚組織TGF-β1免疫組織化學(xué)指數(shù)比較B、C、D組小鼠皮膚組織TGF-β1表達(dá)(135 786±27 942、184 923±31 676、137 293±24 791)與A組(37 582±774)比較均明顯增加(P<0.01)；C組與B組和D組比較,其TGF-β1表達(dá)更加明顯(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖1　各組小鼠皮膚纖維染色圖片(×200)

圖2　各組小鼠皮膚HE染色圖片(×40)

圖3　各組小鼠肺部組織HE染色(×40)

圖4　各組小鼠皮膚TGF-β1免疫組化圖片(×40)

3討論

大量研究結(jié)果證實(shí)SSc的血管病變是造成SSc預(yù)后較差的主要原因〔1～4〕。血管內(nèi)皮細(xì)胞增生及基質(zhì)在血管壁的沉積導(dǎo)致進(jìn)行性血管腔狹窄并最終閉合〔5〕。因而內(nèi)皮細(xì)胞增殖在SSc并發(fā)的血管損害的病理過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。但迄今為止，對(duì)于SSc血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度增殖的發(fā)生機(jī)制尚不明確。有研究認(rèn)為，SSc患者體內(nèi)產(chǎn)生的抗巨細(xì)胞病毒抗體與血管內(nèi)皮細(xì)胞中存在交叉免疫反應(yīng)，繼而引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度修復(fù)反應(yīng)〔6〕。但抗巨細(xì)胞病毒抗體同樣存在于正常人群中，而這一現(xiàn)象在正常人中并未被觀察到〔6〕。SSc作為一種自身免疫性疾病，存在多種針對(duì)自身抗原的抗體如抗核抗體、抗著絲點(diǎn)抗體、抗Scl70抗體等。許多研究者在SSc患者體內(nèi)檢測(cè)出抗血管內(nèi)皮細(xì)胞抗體(AECA)，體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，AECA可以介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡〔7〕。臨床相關(guān)性分析顯示，AECA僅與雷諾現(xiàn)象存在相關(guān)性，與肺動(dòng)脈高壓、肢端壞死性血管病變均無(wú)相關(guān)性〔8〕。在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征等其他風(fēng)濕性疾病也發(fā)現(xiàn)有高滴度AECA，但并未發(fā)生SSc樣的血管病變〔7〕。對(duì)SSc患者體內(nèi)其他自身抗體如抗著絲點(diǎn)抗體、抗拓?fù)涿窱抗體等與SSc血管病變的相關(guān)性分析也未能得出確定的結(jié)果。

對(duì)于C3f多肽片段和DRC3f是否具有生物學(xué)活性這個(gè)問(wèn)題，目前研究甚少。既往的研究證明，補(bǔ)體系統(tǒng)參與了SSc的病理過(guò)程〔9〕。在SSc患者血清中，補(bǔ)體含量增高，補(bǔ)體C3裂解片段C3d在SSc患者血清中也增高，并且C3d∶C3比率增高與SSc病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)〔10〕。但對(duì)于C3f和DRC3f多肽片段在SSc病變過(guò)程中的作用一直未見(jiàn)報(bào)道。本課題組發(fā)現(xiàn)，DRC3f在SSc患者血清中顯著增高，并且DRC3f水平與疾病嚴(yán)重程度、病情活動(dòng)、自身抗體滴度及免疫球蛋白IgG、IgA等增高相關(guān)聯(lián)〔11〕。筆者在體外用富含高水平DRC3f的SSc患者血清刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)富含DRC3f的血清能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖；進(jìn)一步采用人工合成的C3f和DRC3f刺激培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，證實(shí)DRC3f能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，但對(duì)成纖維細(xì)胞無(wú)作用〔11〕。這些結(jié)果表明：C3f和DRC3f在SSc發(fā)生血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖過(guò)程中起關(guān)鍵性作用。

目前用Blm建立局部硬皮病模型比較普遍，其可能機(jī)制主要是促使組織中T 淋巴細(xì)胞增多，尤其是CD8 細(xì)胞增多為主，其次是使得活性氧自由基釋放增多從而導(dǎo)致DNA 解鏈或斷鏈，增加磷脂酶A2 的活性，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，刺激成纖維細(xì)胞的增殖、膠原增加，引起纖維化〔14〕。但Blm誘導(dǎo)的SSc 鼠無(wú)血管變化或自身抗體，皮膚纖維化程度低且持續(xù)時(shí)間短。本研究表明，聯(lián)合注射DRC3f的小鼠局部DRC3f增多，可以明顯促進(jìn)皮膚的纖維化程度，促進(jìn)血管病變，并上調(diào)TGF-β1的表達(dá)。

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〔2015-12-03修回〕

(編輯袁左鳴)

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81260458)；湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2012FFA061)

通訊作者：向陽(yáng)(1961-)，男，碩士生導(dǎo)師，教授，主要從事風(fēng)濕免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制研究。

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R392.3

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)13-3092-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.002

Effection of DRC3f on the dermatofibrosis and TGF-β1 expression of systemic sclerosis mice

CHEN An-Ping,XIANG Wen-Wen,XIA Yan,et al.

Institute of Rheumatology and Immunology, Affiliated Hospital of Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000, Hubei, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effection of DRC3f in the dermatofibrosis and TGF-β1 expression of systemic sclerosis mice.MethodsThe systemic sclerosis mice model was made by hypodermic of DRC3f combined with Bleomycin.The expression of TGF-β1 and the level of dermatofibrosis were detected by immunohistochemistry and fibro-stain respectively.ResultsThe level of dermatofibrosis and the expression of TGF-β1 were much higher in the group which was injected of DRC3f combined with Bleomycin.ConclusionsThe DRC3f might probably promote the dermatofibrosis and the expression of TGF-β1 of systemic sclerosis mice.

【Key words】DRC3f; Systemic sclerosis mice; Dermatofibrosis; TGF-β1

1湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院病理科2湖北民族學(xué)院科技學(xué)院

第一作者：陳安平(1981-),女,碩士,主治醫(yī)師,主要從事風(fēng)濕免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制研究。