張　恒，任寧濤，劉　寧，李　潔，王　征，毛克亞，崔　賡

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模擬失重雌雄大鼠骨密度、骨代謝指標與骨折風險的相關性

張恒1，任寧濤1，劉寧2，李潔3，王征1，毛克亞1，崔賡1

100853北京，解放軍總醫(yī)院：1.骨科，3.婦產(chǎn)科；2.710032西安，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院骨科

【摘要】目的分析模擬失重雌、雄性大鼠模型骨密度及骨代謝生化指標和生物力學之間的相關性，與骨折風險建立聯(lián)系，探討航天醫(yī)療基礎工作。方法3個月齡雌、雄性SD大鼠各20只，按照性別及是否失重分為4組。采用尾部懸吊模擬失重方法，實驗4周后處死SD大鼠，雙能X線吸收法(dual-energy X-ray absorption, DEXA)測定L4椎體、股骨髁部骨密度，骨組織切片染色，ELISA法檢測骨代謝生化標志物：骨堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase，BALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)，生物力學測試骨強度。結(jié)果懸吊組大鼠較對照組大鼠BMD均顯著下降，雌性懸吊組較雄性組下降明顯；組織切片懸吊組較對照組骨組織及骨細胞間隙明顯增寬，細胞腫脹；BALP、TRAP雄性懸吊組分別較對照組升高3.09和1.72倍，雌性懸吊組分別較對照組升高3.43和2.14倍；懸吊組椎體的最大壓縮載荷(N)、最大壓縮壓力(MPa)、股骨最大抗彎曲載荷(N)懸吊組較對照組顯著下降。骨密度(bone mineral density，BMD)、BALP、TRAP與椎體最大力學強度Fmax相關性系數(shù)r值，雄性組分別為0.985、-0.949、-0.970，雌性組分別為0.908、-0.858、-0.921。結(jié)論失重4周后大鼠出現(xiàn)明顯的骨質(zhì)疏松、骨小梁結(jié)構(gòu)破壞、力學強度顯著下降。雌性大鼠骨質(zhì)疏松較雄性組明顯加重。最大力學強度Fmax與骨密度成正相關，與BALP、TRAP成負相關，未來精準、便捷的骨代謝指標可能成為航天醫(yī)學預測骨折風險的手段之一。

【關鍵詞】模擬失重；骨質(zhì)疏松；骨生化標記物; 生物力學；相關性

失重狀態(tài)下導致的骨質(zhì)疏松、肌肉萎縮、心血管功能紊亂、泌尿系結(jié)石等成為近年來航天醫(yī)學研究的重點[1, 2]。美國國家航空航天局(National Aeronautics and Space Administration, NASA)提出一項新的研究領域：空間生命科學，旨在解決人類離開地球后生理功能的病理性改變[3]。因航天員的數(shù)量有限及人體試驗的倫理等約束，目前針對航天員的在體實驗很難開展。NASA研究員不斷探索實驗模型，Morey-Holton教授提出的大鼠尾部懸吊模型(tail suspended, TS)得到與有限的太空實驗相似的實驗結(jié)果，并被公認為目前最合理的活體失重模型[4-8]。失重引起的骨質(zhì)疏松從骨密度、骨小梁三維微觀結(jié)構(gòu)、細胞通路方面已得到相關驗證[9, 10]。在太空或空間實驗室條件下，由于空間及目前技術所限，缺乏地面上大型骨密度測量儀器，如何精確地預測航天員的骨折風險是航天醫(yī)學的重點和難點，目前國內(nèi)外研究較少。本研究設計通過骨代謝生化標記物與骨密度及力學性能的相關性，與骨折風險建立聯(lián)系，進而對航天員的航天醫(yī)療工作提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗動物成年健康3個月齡Sprague Dawley(SD)大鼠40只，體重(220±16)g,此生長發(fā)育階段的SD大鼠處于骨密度峰值期(peak bone mineral density, PBMD)[11]，減少發(fā)育期骨密度的增長產(chǎn)生的誤差。按性別比及試驗處理分為4組，雄性對照組、雄性懸吊組、雌性對照組、雌性懸吊組，每組10只。

1.2主要儀器XJ828生物力學試驗機(MTS 858 bionix，美國)，雙能X線吸收骨密度儀及配套的小動物分析軟件(DEXAHOLOGIC公司，美國)，Leica-LA 2500輪轉(zhuǎn)式硬組織切片機(LEICA公司，德國)，Leica-LA全自動顯微鏡(Olympus CX31，日本)，大鼠TRAP ELISA試劑盒、大鼠BALP ELISA試劑盒(Groundwork Biotechnology Diagnosticate Ltd，美國)，Du7HS型紫外分光光度計(Beckman公司，美國)。

1.3實驗方法

1.3.1失重大鼠模型的建立按照Morey-Holton教授提出的尾部懸吊模型制造模擬失重模型[4]。試驗組后肢懸垂脫離水平面，與頭部約成30°夾角，大鼠可自由飲食和旋轉(zhuǎn)活動，光照黑暗時間各12 h。設置相同飲食和光照的對照組。

1.3.2取材與骨密度分析于第4周后處死，取L4椎體、股骨行骨密度，掃描精度1%，ACF= 1.037，BCF=1.024，掃描類型：hHi-Res，掃描模式：Discovery Wi(S/N 83860)，應用小動物測量專用分析軟件。

1.3.3組織切片觀察L5椎體打磨表面軟組織后，經(jīng)10%的甲醛溶液固定2周，乙醇逐次脫水后，于塑料液內(nèi)包埋并固化成塊，并切成50～100 μm切片。根據(jù)改良的麗春紅染色方法染色后，制成不脫鈣切片，顯微鏡下觀察骨組織情況。

1.3.4血清骨代謝生化標記物檢測實驗到期后利用2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)對SD大鼠腹腔注射麻醉，心臟取血4～5 ml,靜置20 min后，于高速離心機內(nèi)4500 r/min，離心6 min，取上層血清，-80 ℃低溫冰箱凍存，待檢測。檢測前提前12 h常溫解凍，ELISA法檢測血清BALP、TRAP的含量(大鼠TRAP ELISA試劑盒Groundwork Biotechnology Diagnosticate Ltd.美國；大鼠BALP ELISA試劑盒Groundwork Biotechnology Diagnosticate Ltd.美國；Du7HS型紫外分光光度計 Beckman公司，美國)，繪制LOGIT-LOG曲線圖，并計算其含量。

1.3.5生物力學測試在萬能材料試驗機上(MTS858 systeminc，minneapolis，USA)，采用軸向加壓測試椎體松質(zhì)骨的力學強度(單位：N、MPa)。采用三點預彎試驗測量皮質(zhì)骨的力學強度(單位：N)。測量時 ,切除椎體椎弓及附件，砂紙磨除椎體上下表面，使平面相互平行，卡尺測量椎體高度，根據(jù)阿基米德原理計算其體積，計算椎體橫斷面積。椎體加載速度1 mm/min，股骨支點跨距16 mm，加壓點為中點，加載速度1 mm/min，加載至骨折，計算機記錄載荷-位移曲線。計算出最大抗壓縮載荷及應力。

1.3.6觀察指標懸吊結(jié)束后密切觀察大鼠的飲食、糞便、體重、毛發(fā)等一般指標，骨密度，骨組織切片、骨代謝生化標記物BALP、TRAP含量，生物力學最大壓縮應力、最大壓縮載荷、股骨三點彎曲強度。

2結(jié)果

2.1一般指標SD大鼠在試驗過程中飲食、排便及一般活動正常，體重增加與空白對照組間差異不明顯，各組均無脫毛、斷尾及死亡現(xiàn)象發(fā)生(表1)。

2.2骨密度各組間骨密度的基線值組間差異可能無統(tǒng)計意義。失重實驗后，不同性別懸吊組大鼠均較空白對照組骨密度下降(P<0.01)，其中雄、雌性組失重后骨密度分別降低18.4%和29.1%。同時，雌性懸吊組較雄性懸吊組骨密度下降明顯(P<0.05，表2)，差異有統(tǒng)計學意義。

2.3組織學L5椎體改良麗春紅染色后組織形態(tài)學觀察(圖1)。50倍顯微鏡下觀察到懸吊組SD大鼠的骨小梁組織結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為明顯的“蜂窩樣”改變，提示懸吊組出現(xiàn)明顯的骨質(zhì)疏松，骨小梁結(jié)構(gòu)從組織、細胞水平遭到破壞，雌性組較雄性組上述改變更明顯。

2.4骨代謝標記物表3示血清BALP、TRAP的含量的統(tǒng)計結(jié)果。失重實驗結(jié)束后，雌雄性空白對照組間血清BALP、TRAP含量統(tǒng)計無差異，不同性別間懸吊組均較空白對照組血清BALP、TRAP升高(P<0.05)，雄性懸吊組分別較對照組升高3.09和1.72倍，雌性懸吊組分別較對照組升高3.43和2.14倍。雌性懸吊組較雄性懸吊組血清BALP、TRAP升高更明顯(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。

2.5生物力學實驗見表4。兩對照組間力學測試結(jié)果無統(tǒng)計差異，不同性別懸吊組大鼠的腰椎的最大壓縮載荷、最大壓縮應力、股骨的最大抗彎曲載荷均較空白對照組顯著下降(P<0.05)，雄性懸吊組分別較對照組下降27.6%、26.4%、24.7%，雌性懸吊組分別較對照組下降36.6%、33.1%、34%，力學強度顯著下降。雌性失重大鼠較雄性失重大鼠力學強度下降更明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.6力學強度與骨密度、血清BALP、TRAP含量參數(shù)的相關系數(shù)預測骨折風險結(jié)果表5示雄、雌性大鼠椎體Fmax與骨密度、骨生化標志物的線性相關分析結(jié)果。骨密度與椎體最大力學強度在雄性組和雌性組均成明顯正相關(P<0.05)，血清BALP、TRAP與椎體最大力學強度在雄性組和雌性組均成明顯的負相關(P<0.05)，且兩組間有較好的一致性。

表1　兩組大鼠實驗建模4周后觀察指標比較　(n=10；±s)

注：均能正常活動，無脫毛、斷尾和死亡

圖1　L5椎體形顯微鏡下形態(tài)學觀察(改良麗春紅染色，×50)

；g/cm2)

注：與對照組比較，①P<0.05；與雄性懸吊組比較，②P<0.05

表3　ELISA法檢測不同性別SD大鼠模擬失重后骨代謝生化標記物BALP、TRAP含量　(n=10；

注：與對照組比較，①P<0.05；與雄性懸吊組比較，②P<0.05

表4　實驗大鼠模擬失重后椎體最大壓縮載荷、最大壓縮壓力及股骨最大抗彎曲載荷指標比較　(n=10；±s)

注：與對照組比較，①P<0.05；與雄性懸吊組比較，②P<0.05

表5　雄、雌性大鼠模擬失重后椎體Fmax與BMD、骨生化標志物的線性相關分析

3討論

3.1失重與骨質(zhì)疏松失重性骨質(zhì)丟失主要發(fā)生在脊柱、骨盆及股骨等承重骨，且以松質(zhì)骨分布區(qū)域的骨量丟失為主,而顱骨、顳骨等變化不明顯[12]。其機制：成骨細胞的活性降低，破骨細胞的活性增強，骨形成與骨吸收代謝失平衡，導致骨密度降低，骨小梁的三維立體結(jié)構(gòu)破壞，正常的H形結(jié)構(gòu)變細、疏松，力學性能明顯下降[3, 13]。尾部懸吊大鼠后肢處于人工失重狀態(tài)，體液頭像分布，NASA 在太空飛行實驗中進行的動物實驗與地面尾部懸吊實驗數(shù)據(jù)進行比較，該模型與太空飛行時大鼠或宇航員處于的失重狀態(tài)相似，該模型引起的應激程度輕微，大鼠體質(zhì)量增長與正常大鼠接近，可用來對長期失重生理影響及其機制進行研究[14, 15]。

3.2失重與骨骼骨密度改變太空中承重骨骼以每月1.6%的速率丟失，宇航員返回地球后普遍出現(xiàn)立位耐力不良，腰背部、關節(jié)肌肉疼痛等癥狀，甚至出現(xiàn)骨質(zhì)疏松性骨折[16]。Pecaut等[17]發(fā)現(xiàn)，失重導致肌肉和骨骼應力刺激減少，易導致骨密度降低，肌肉萎縮，運動功能較低。俄、美聯(lián)合研究表明：在長達14.5個月的微重力環(huán)境下，宇航員下肢骨密度下降明顯，股骨下降(8.17±1.24)%，骨盆下降(11.99±1.22)%[16]。徐叢等[18]研究骨密度與極限應力成明顯的正相關(r=0.765)。Ebbesen等[19]發(fā)現(xiàn)，最大生物力學強度與骨密度成明顯正相關(r=0.88)。本研究與國內(nèi)外研究結(jié)果有較好一致性。失重后雌雄性大鼠骨密度較對照組明顯降低，鏡下觀察骨形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，懸吊組雌、雄大鼠椎體骨質(zhì)疏松樣改變明顯，骨小梁不連續(xù)、變細、間隙增大明顯。雌性大鼠骨密度及顯微鏡下圖像分析結(jié)果較雄性組骨質(zhì)疏松嚴重，這可能是性別不同、生理結(jié)構(gòu)差異，以及激素水平差異所致，后期筆者將對此進行進一步探索。

3.3失重與骨代謝標記物失重和模擬失重導致的骨丟失主要以骨形成受抑制為主，成骨細胞的分化下降，細胞內(nèi)代謝紊亂抑制了成骨細胞的成骨能力[20]。Aguirre等[21]發(fā)現(xiàn)，尾吊模型中破骨細胞數(shù)量增加且活性增強。Nakamura等[22]證實，失重狀態(tài)下BALP下降，TRAP增加。尿羥脯氨酸(HOP)為經(jīng)典的骨吸收標記物，但易受飲食影響，且懸吊大鼠尿液采集存在困難。本實驗以TRAP代替HOP，實驗靈敏度、準確性均較高。BLAP、TRAP分別從成骨細胞、破骨細胞水平間接反映骨形成與骨吸收，較好地體現(xiàn)了骨重建與骨轉(zhuǎn)換。Kapitonova等[23]指出，實際太空飛行實驗后，BALP表達及活性增高，這可能是細胞的一種代償反應，僅有BALP活性增高可使成骨細胞分化，但無法使其礦化，這可能是BALP 升高未使骨丟失改善的原因。本研究中，BLAP、TRAP均升高，與Nakamura等[22]的實驗結(jié)果有偏差，與Kapitonova等[23]研究一致。經(jīng)分析認為，BLAP、TRAP均增高主要是因為SD大鼠模擬失重狀態(tài)下骨轉(zhuǎn)換率增強，骨礦化功能障礙，骨吸收大于骨沉積，造成了骨代謝的負平衡，也是引起骨量丟失的主要原因。

3.4失重與生物力學生物力學作為骨質(zhì)疏松應力性骨折的檢測手段，通過直觀的最大應力數(shù)值驗證模擬失重狀態(tài)下骨密度及骨小梁結(jié)構(gòu)改變帶來的力學強度降低。骨代謝標記物與生物力學相關性研究已成為當前研究熱點之一[24]。在太空條件下，由于缺乏地面的大型骨密度測量儀器，筆者認為通過目前實驗研究測定骨生化標記物、骨密度與骨折風險建立理論相關性聯(lián)系，后期的深入研究可根據(jù)骨生化代謝指標預測骨折風險。本實驗中雌、雄性SD大鼠椎體最大力學強度Fmax與骨密度成顯著正相關，與BLAP、TRAP成負相關。精準、簡便的骨代謝指標與骨折風險相聯(lián)系，將可能是未來航天醫(yī)學的研究熱點。此外，隨著研究的深入，骨代謝標記物用于航天員骨質(zhì)疏松篩查或流行病學的研究也將成為可能。

本研究論證了模擬失重狀態(tài)骨密度、BLAP、TRAP的變化與生物力學的相關性，未來精準、便捷地檢測骨代謝指標可能成為航天醫(yī)學預測骨折風險的手段之一。

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(2015-11-03收稿2016-03-15修回)

(責任編輯岳建華)

基金項目：1.全軍武器預研基金(9140A7040109JB1003)；2.航天醫(yī)學基礎與應用國家重點實驗室開放基金(SMFA15K03)

作者簡介：張恒，碩士研究生，醫(yī)師。 通訊作者：崔賡，E-mail:cuigeng@aliyun.com

【中國圖書分類號】R852.22

The relationship between BMD, biochemical marker parameters and fracture risk for simulated weightlessness in male and female rats

ZHANG Heng1, REN Ningtao1, LIU Ning2, LI Jie3, WANG Zheng1, MAO Keya1, and CUI Geng1.

1.Department of Orthopaedic, 3. Department of Obstetrics and Gynecology, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China；2. Department of Orthopaedics, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China

【Abstract】ObjectiveTo analyze the changes of BMD, biochemical marker parameters, mechanical properties in male and female rat osteoporosis models in simulated weightlessness comparatively to establish relationship and predict fracture risk.Methods40 3-months-old SD rats were selected, 20 males and 20 females. According to the gender, they were divided into 4 groups at random: experimental group and reference group. The t Tail suspended models (TS) were measured. After 4 weeks, the rats were killed, the BMD of L4 and femoral condyle by dual-energy X-ray absorptiometry (DEXA) were measured, the osteal tissue slices were stained by the way of poncean, the marks of bone biochemical metabolism in serum were detected by ELISA and the biomechanics was tested by biomechanical testing machine.ResultsThe BMD of L4 lumbar vertebrae and femoral condyle in the experimental groups are obviously lower than the reference groups. The bone metabolic biochemical markers (BLAP & TRAP) in TS groups were remarkably higher than in the reference groups. The correlation coefficient R values between Fmax and BMD, BLAP, TRAP in male groups were 0.985, -0.949, -0.970, and in female group were 0.908, -0.858, -0.921.ConclusionsFor 4 weeks simulated weightlessness, obvious osteoporosis, destruction of the microstructure, decrease of the mechanical strength are manifested. Fmax is positively correlated with BMD, and negative correlation for BLAP, TRAP. It is a precise and convenient bone metabolism index to predict fracture risk in space medicine and is a feasible, precise and convenient bone metabolism index to predict fracture risk in space medicine.

【Key words】simulated weightlessness；osteoporosis； biochemical marker；biomechanics；correlation