張淼，王文君，祝鵬宇，郭穎，李書霖（.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 5000；.黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱 50040；.黑龍江省中醫(yī)藥管理局，哈爾濱 50090）

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·動物實驗·

針刺內關穴對心肌肥厚小鼠心肌組織超微結構的影響

張淼1，王文君2，祝鵬宇1，郭穎1，李書霖3
（1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學，哈爾濱 150040；3.黑龍江省中醫(yī)藥管理局，哈爾濱 150090）

【摘要】目的觀察針刺內關穴對小鼠心肌肥厚狀態(tài)的影響。方法將36只健康C57BL6小鼠隨機分為空白組、模型組和治療組，每組12只。治療組針刺內關穴，每日1次，每次留針15 min。治療9 d后，比較各組心臟重量/脛骨長度值的變化。對各組小鼠左心室心肌組織行Masson三原染色法，采用普通光學顯微鏡在100倍視野下觀察各組心肌纖維排列及膠原纖維分布的差異。并用透射電子顯微鏡觀察受損心肌組織肌節(jié)結構，肌原纖維排列，膠原纖維及線粒體等超微結構。結果與空白組比較，模型組心率顯著增快，治療組心率顯著降低。模型組和治療組心臟重量、心臟重量/脛骨長度比值均較空白組顯著增加（P ＜0.01）；治療組心臟重量、心臟重量/脛骨長度比值均較模型組顯著降低（P＜0.01）。模型組心肌組織出現(xiàn)代償性肥大且呈現(xiàn)不連續(xù)狀態(tài)，少數(shù)心肌橫紋出現(xiàn)嚴重紊亂/斷裂，核固縮及胞漿嗜酸性變明顯；治療組優(yōu)于模型組。模型組部分肌原纖維灶性融合，間質膠原纖維增生，線粒體腫脹及代償性增多，治療組優(yōu)于模型組。結論針刺內關穴能夠減少膠原纖維及線粒體等的產生，整合肌節(jié)結構排列，延緩心肌肥厚的進展。

【關鍵詞】針刺療法；穴，內關；心肌肥厚；超微結構；小鼠

慢性心力衰竭（CHF）是由于各種增加心臟負荷的因素誘發(fā)心室重構，導致心臟泵血功能障礙而引起的病理疾患［1］，機理復雜且持續(xù)進展加重。心功能因各種誘因受損早期，心肌收縮力逐漸減弱，為保證心臟正常的血液輸出，機體補充建立以心肌肥厚為主的代償機制［2］。代償以心肌纖維增生為主，伴隨線粒體增大和變多，為克服心臟壓力負荷，需維持相當?shù)男呐叛恐敝潦Т鷥敗?/p>

近年來炎癥和心肌肥厚的關系受到研究者們的廣泛關注，微炎癥作為一種低強度、慢性進展的非顯性炎癥狀態(tài)，貫穿了心肌代償?shù)恼麄€過程，是心肌肥厚進展加重進入失代償階段的重要因素［3］。炎性狀態(tài)對心肌影響除部分炎癥因子增多外，主要見于心肌間質水腫，炎細胞浸潤及肌纖維變性、壞死，后期顯示炎細胞浸潤減少消失，間質有明顯灶性病理改變。針灸特定穴已被眾多實驗證明對于調節(jié)改善炎性狀態(tài)有較好的作用［4］，而針刺對于心肌肥厚的影響作為針灸抗炎理論的一種具體探索方向值得研究。本實驗觀察針刺內關穴對心肌肥厚小鼠心肌組織超微結構的影響，現(xiàn)報告如下。

1　材料和方法

1.1實驗動物

C57BL6小鼠36只，雄性，6～8周，體重為20～25 g，清潔級［SCXK（吉）-2013-0005］，動物喂養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學針灸實驗室，小鼠適應性喂養(yǎng)1星期后實驗。

鹽酸異丙腎上腺素注射液（ISO），Masson染色試劑盒購自珠海貝索生物技術有限公司。

1.3實驗分組

36只小鼠隨機分為正常組、模型組和治療組，每組12只。治療組針刺內關穴（參照《實驗動物針灸穴位圖譜》結合人體穴位定位），留針15 min，期間每5 min輕微捻轉針1次，30 min后腹腔注射 ISO（15 mg/kg）。每日1次，共治療9 d。正常組注射等量生理鹽水，持續(xù)9 d。模型組每日注射ISO（15 mg/kg），持續(xù)9 d［5］。

1.4觀察指標

治療完成后描記小鼠心電，電子天平稱重，3%水合氯醛（0.1 mL/10 g）麻醉后斷頸，參照小鼠立體定位圖譜取材，記錄心臟重量，游標卡尺準確測量脛骨長度（后肢內踝下緣至脛骨平臺），計算心臟質量/脛骨長度。切下左心室心肌組織按試劑盒步驟說明行MASSON染色［6］。在普通光學顯微鏡下觀察，倍數(shù)選取100倍來觀察各組鏡下結構的差異。左心室區(qū)仔細切取1 mm× 3 mm×1 mm心肌組織3～4塊，制作超薄切片置FEI/ Philips TCNAI G2型透射電子顯微鏡下觀察、拍片，每個標本拍片3～5張（放大11500倍）。

1.5統(tǒng)計學方法

用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據以均數(shù)±標準差表示，各組數(shù)據經過正態(tài)性檢驗和方差的齊性檢驗后便可進行統(tǒng)計分析，組間比較用單因素方差分析（one-way ANOVA檢驗）和t檢驗。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1小鼠心率（HR）的變化

如表3所示，PP注塑件氣味在第20天的時候強度降低，之后穩(wěn)定在2.5級，主要是由于殘存在PP注塑件表面的小分子物質隨著時間延長逐步揮發(fā)，之后與空氣中的小分子達成平衡，在沒有高溫的作用下，趨于穩(wěn)定狀態(tài)。如圖2所示，隨著時間的延長，甲醛、乙醛含量逐步降低，在15～20 d的時候，殘留在PP注塑件表面的醛類物質隨空氣流通揮發(fā)，然后是熱氧化降解的醛類物質隨著時間的延長慢慢釋放，直至檢測不到。所以，在標準實驗室條件下，PP注塑件放置20 d，氣味、VOC可以達到一個較好的狀態(tài)。

由圖1可見，各組小鼠心率差別明顯，相較于空白組，模型組心率增快，治療組心率降低。

圖1　各組小鼠心率

2.2各組小鼠心臟質量、脛骨長度比較

由表1可見，模型組和治療組小鼠心臟重量及心臟重量/脛骨長度比值與空白組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。模型組小鼠心臟重量及心臟重量/脛骨長度比值與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。提示動物模型的建立是比較成功的，針刺內關穴可以使小鼠心臟重量及心臟重量/脛骨長度比值降低，其數(shù)值較模型組有顯著性差異，證明治療方法是有效的。

表1　各組小鼠心臟質量、脛骨長度比較　（±s）

表1　各組小鼠心臟質量、脛骨長度比較?。ā纒）

注：與空白組比較1）P＜0.01；與模型組比較2）P＜0.01

組別　n　心臟重量（mg）　脛骨長度（mm）　心臟重量/脛骨長度（mg/mm）空白組　12　119.17±9.96　17.23±1.38　6.93±0.48模型組　12　146.67±14.971）　16.42±0.77　8.93±0.781）治療組　12　138.72±18.441）2）　17.87±2.23　7.76±0.611）2）

2.3各組光鏡下MASSON染色心肌纖維化比較

為區(qū)別于HE染色，鏡下組織間質充斥的膠原纖維被染為藍色。空白組顯示心肌纖維排列整齊，形態(tài)完整，胞漿豐富，胞核飽滿。細胞邊界清晰，細胞核位于肌纖維中央，心肌間質和心肌未見異常。心肌細胞的縱切面橫紋清晰，細胞核居中，少量血管及結締組織分布。橫切面為不規(guī)則的多角形，核周圍可見點狀放射狀排列的肌原纖維。相比于空白組，模型組心肌組織出現(xiàn)代償性肥大且呈現(xiàn)不連續(xù)狀態(tài)，心肌細胞炎性浸潤明顯，間質密布藍色膠原纖維，少數(shù)心肌橫紋出現(xiàn)嚴重紊亂/斷裂，核固縮及胞漿嗜酸性變明顯。治療組與模型組比較，心肌細胞間質藍色膠原纖維減少，細胞紊亂明顯減輕。詳見圖2。

2.4各組電鏡下心肌細胞超微結構比較

空白組基本結構清晰，肌原纖維排列規(guī)則，可見成排線粒體分布于肌原纖維間，內外膜完整，嵴清晰。模型組線粒體內外膜不清晰，部分線粒體嵴絮狀變性，肌節(jié)明暗帶部分融合消失，部分肌原纖維灶性融合，間質膠原纖維增生，線粒體發(fā)生腫脹及代償性增多。治療組肌節(jié)結構尚可，肌原纖維未見損傷，少量線粒體腫脹，漿細胞不明顯。詳見圖3。

圖2　各組光鏡下MASSON染色心肌組織結構（×100）

圖3　各組電鏡下心肌細胞超微結構（×11500）

3　討論

心肌肥厚屬于中醫(yī)學“胸痹”“心痛”范疇，《普濟方·針灸》：“穴內關主心中憒憒?！薄妒備洝罚骸皟汝P，系于心包絡，心系實則心痛，虛則為煩?！薄队颀埥洝罚骸瓣幘S為病苦心痛。”《二十八難》：“陰維，起于諸陰交也，維絡諸陰脈會于任脈?！敝T經行于胸腹脅肋，其循行主治與《醫(yī)宗金鑒》相印證，即內關穴主治氣塊上攻心胸，脅肋疼痛。

在脊神經節(jié)的外周部位，心臟及心神經的內臟傳入纖維與內關區(qū)的傳入神經纖維有2～3個節(jié)段的重疊，而以Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ為主的脊髓各板層又交匯于中樞部位［7-8］，理論上針刺內關穴處的神經纖維可引起心臟區(qū)的神經調節(jié)，對心肌細胞的異常狀態(tài)產生一定的調節(jié)作用。連接內關的纖維可以經由迷走神經節(jié)和脊神經節(jié)的神經元傳導信號到達連接心臟的神經纖維，而迷走神經可能作為一個重要環(huán)節(jié)參與針刺對肥大心肌產生的一系列影響。

ISO作用于心臟β1受體，使心收縮力增強，傳導加速。小鼠注射異丙腎上腺素后，心輸出量和心肌耗氧量增加，心率增快，表現(xiàn)為模型組小鼠心率明顯高于空白組。針刺通過抑制前額葉內側區(qū)對自主神經系統(tǒng)起調節(jié)作用，可增加副交感神經活性，降低交感神經活性，且副交感神經的活性與針刺得氣的程度呈正相關［9］。因此，治療組小鼠心率相比模型組呈明顯下降趨勢。

機體因生長產生的體重波動，使得用體重作為衡量正常心臟重量的參考值具有不可靠性。比較體重作為標準，以往的研究數(shù)據顯示更同意通過脛骨長度估算心臟重量，這使我們能夠排除縱向生長的因素干擾［10］。心肌代償性肥大導致心臟重量呈現(xiàn)上升趨勢，同時實驗因素對于各組間小鼠脛骨長度影響有限，使得結果中模型狀態(tài)小鼠系數(shù)值顯著高于正常狀態(tài)。

心肌組織鏡下以炎性浸潤及纖維化為主要表現(xiàn)，組織中Ⅰ/Ⅲ型膠原比例增加、過量沉積且分布雜亂，是由冠狀動脈粥樣硬化性狹窄狀態(tài)引起的心肌缺血缺氧所導致［11］，伴鄰近心肌纖維增粗或萎縮，可能源于后負荷增加導致冠脈動脈內皮產生缺陷，易受內部血液流動沖擊的影響，破壞膠原分泌的平衡［12］。在冠脈周圍，AngⅡ的活性及其表達均高于其他部位［13］，可以激活心肌成纖維細胞合成大量的膠原纖維。心肌缺血缺氧等因素引起的心臟異常重構過程中，組織細胞的損傷可導致機體的免疫-炎癥反應，相關分子物質受到刺激激活釋放到細胞間質或血液中，鏡下可表現(xiàn)出明顯炎性浸潤。

超微結構下，心肌組織肌節(jié)結構的紊亂是心臟功能出現(xiàn)異常的直接原因。心肌肥厚代償過程中肌節(jié)結構發(fā)生明顯異常，肌節(jié)明暗帶隨之消失，內外膜結構發(fā)生異常，通常伴隨線粒體數(shù)量和體積的變化。線粒體一方面通過ATP合成參與能量供應，一方面也進一步對細胞凋亡形成調控機制［14］。利用ISO誘導心肌肥厚模型的損傷機制相當復雜，打亂線粒體能量代謝、神經體液調節(jié)紊亂和誘導細胞進一步凋亡等導致心肌細胞病理改變［15］。心力衰竭發(fā)生時將導致氧氣和能量供應下降［16-19］，機體產生反饋性病理刺激，導致出現(xiàn)離子水平異常和線粒體腫脹明顯，內膜和嵴斷裂或缺損，嵴排列不規(guī)則。

本實驗結果顯示，治療組小鼠治療后心率及心臟重量/脛骨長度比值較模型組顯著降低，光鏡鏡下膠原纖維分布較模型組減少，炎性浸潤改善；超微結構顯示肌節(jié)排列結構明顯優(yōu)于模型組，內外膜基本完整，僅部分線粒體腫脹。研究從形態(tài)學證實了針刺內關穴能夠改善異丙腎上腺素造成的心肌細胞損傷，改善細胞內外的炎性狀態(tài)，對心臟有一定的保護作用。而針刺過程中涉及的具體神經體液調節(jié)方式尚待進一步研究。

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【中圖分類號】R2-03

【文獻標志碼】A

DOI：10.13460/j.issn.1005-0957.2016.05.0588

文章編號：1005-0957（2016）05-0588-04

收稿日期2016-01-22

基金項目：黑龍江省自然科學基金項目（H201315）；哈爾濱市應用技術研究與開發(fā)項目（2013RFQYJ076）

作者簡介：張淼（1973-），女，教授，碩士生導師

通信作者：李書霖（1973-），男，博士生

Effect of Acupuncture at Point Neiguan on Myocardial Ultramicrostructure in Myocardial Hypertrophy Mice

ZHANG Miao1，WANG Wen-jun2，ZHU Peng-yu1，GUO Ying1，LI Shu-lin3.
1.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine Second Hospital，Harbin 150001，China；2.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，China；3.Heilongjiang Province Administration of Traditional Chinese Medicine

［Abstract］ObjectiveTo investigate the effect of acupuncture at point Neiguan on mouse myocardial hypertrophy.Methods Thirty-sixty healthy C57BL6 mice were randomized into blank，model and treatment groups，12 rats each.In the treatment group，an acupuncture needle was inserted into point Neiguan and retained for 15 min，once daily.After nine days of treatment，the ratios of cardiac weight/tibial length were compared between the groups.Left ventricular myocardial tissues were processed by Masson trichrome staining in every group of mice.The differences in myocardial fiber arrangement and collagen fiber distribution between the groups were observed under the ordinary optical microscope in 100 times of field of vision.Sarcomere structure，myofibril arrangement，collagen fibers and mitochondria in injured myocardial tissues were observed by transmission electron microscopy. ResultsHeart rate increased significantly in the model group and decreased significantly in the acupuncture group compared with the blank group.Cardiac weight and the ratios of cardiac weight/tibial length increased significantly in the model and acupuncture groups compared with the blank group（P＜0.01）and decreased significantly in the acupuncture group compared with the model group（P＜0.01）.In the model group，myocardial tissues had compensatory hypertrophy with incontinuous status，and myocardial transverse striations had severe disorder/disruption，karyopyknosis appeared and cytoplasmic eosinophilic change became obvious in few of the rats.The results were better in the acupuncture group than in the model group.In the model group，part of myofibrils had focal fusion，interstitial collagen fibers proliferated and mitochondria had swelling and compensatory increase.The results were also better in the acupuncture group than in the model group.ConclusionsAcupuncture at point Neiguan can reduce the production of collagen fibers and mitochondria，improve the arrangement of sarcomere structure and delay the progression of myocardial hypertrophy.

［Key words］Acupuncture therapy；Point，Neiguan；Myocardial hypertrophy；Ultramicrostructure；Rats