徐　延，蔣英麗，程　偉，李維捷，孟資寬，高　鴻，羅愛民（.四川大學(xué)食品工程系，四川成都60064； .四川省古藺郎酒廠有限公司，四川古藺6800）

正交法優(yōu)化醬香型大曲類黑素提取工藝

徐延1，蔣英麗2，程偉2，李維捷1，孟資寬1，高鴻1，羅愛民1
（1.四川大學(xué)食品工程系，四川成都610064； 2.四川省古藺郎酒廠有限公司，四川古藺618200）

摘要：為了優(yōu)化提取醬香型大曲類黑素的工藝條件，采用L9（34）正交設(shè)計，以醬香型大曲為提取原料，以乙醇溶液為提取溶劑，以類黑素濃度為考察指標(biāo)，研究了提取濃度、提取溫度、液固比和提取時間等單因素對提取效果的影響。結(jié)果表明，提取濃度、提取溫度、液固比和提取時間對類黑素終濃度的影響均達到顯著水平，其影響程度為液固比＞提取濃度＞提取時間＞提取溫度。確定醬香型大曲類黑素最佳提取條件為：提取溫度70℃，提取濃度

40%，提取時間3 h，液固比17.5∶1?？勺鳛樯钊胙芯酷u香型大曲的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大曲； 類黑素； 正交實驗； 提取工藝

醬香型白酒是中國白酒的五大香型之一［1］，具有醬香突出、酒體醇厚、幽雅細膩、回味悠長的風(fēng)格特點［2-4］，它獨特的香型與其獨特的釀造工藝有著密不可分的關(guān)系，其典型代表是貴州茅臺酒和四川郎酒。醬香型白酒的特殊工藝之一是高溫制曲［5］，因為釀酒生產(chǎn)中用曲量大，幾乎與制酒原料高粱比為1∶1，曲的質(zhì)量在一定程度上決定了酒質(zhì)的優(yōu)劣，故有“曲乃酒之骨”“好曲出好酒”的說法［6］。影響醬香型大曲質(zhì)量的因素有很多，但主要在于制曲溫度的高低［7］。在高溫培養(yǎng)過程中，發(fā)生美拉德（Maillard）反應(yīng)，由于制曲溫度的不同，形成了3種不同顏色和風(fēng)格的高溫大曲：黑塊曲、白塊曲和黃塊曲。黑塊曲醬香突出并帶有焦香，但糖化力低；白塊曲糖化力較高但醬香味不足；黃塊曲則各項指標(biāo)較為適宜［8-9］。在生產(chǎn)中，黑塊曲若用量少，則可使酒有愉快的焦香；若用量大，則成品酒糊苦味重，以致造成“焦蓋醬”的后果，影響酒的風(fēng)格和質(zhì)量。因此各種風(fēng)格的酒曲的配比對生產(chǎn)高質(zhì)量的酒尤為關(guān)鍵。而實際應(yīng)用中，制曲工人僅憑顏色來對曲塊進行質(zhì)量分級配比，而曲的顏色是漸進變化的，單純的將曲分為黑、白、黃3類進行配比的方法較為粗獷。因此，為了實現(xiàn)生產(chǎn)用曲的精確配比，找到一種表征曲塊質(zhì)量的指標(biāo)尤為重要，而類黑素是美拉德反應(yīng)終產(chǎn)物，呈黑褐色，類黑素含量越高，顏色越深［10］。因此，可用曲塊中類黑素含量來表征曲塊顏色的深淺，進而來判斷曲藥的質(zhì)量。本研究利用單因素及正交實驗，確定了醬香型大曲類黑素的最優(yōu)提取工藝，為進一步對大曲質(zhì)量分級奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

醬香型大曲：采用四川省古藺郎酒廠熟練工人挑選的顏色一致，斷面顏色均一，發(fā)酵良好的生產(chǎn)用成品曲。成品曲打碎后再粉碎過60目篩，取篩下部分烘干至恒重裝入密封袋備用。無水乙醇（分析純，成都科龍化工試劑廠），實驗用水為四川大學(xué)試劑科提供。

1.2儀器與設(shè)備

FW-100高速萬能粉碎機，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；JA1203上皿電子天平，上海精科天平；TDL-4013低速離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SpectraMax 190酶標(biāo)儀，美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1提取工藝流程

大曲粉→稱重→在一定溫度一定液固比下浸提→離心取上清液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→定容→吸光度測定

1.3.2類黑素含量測定

將1.3.1中類黑素提取物用蒸餾水定容于50 mL的容量瓶中，以對應(yīng)體積分數(shù)的乙醇溶液作空白液，在470 nm處測定其吸光度，用下面的公式計算類黑素濃度［11-12］。

C=A/eb

式中：C——類黑素的含量（mmol/L）；

A——樣液的吸光度（470 nm）；

e——類黑素的摩爾消光系數(shù)0.64 L/mmol·cm；

b——比色皿厚度（cm）。

1.4單因素實驗

按1.3.1節(jié)的提取工藝流程，在其他條件相同的情況下，進行單因素實驗，分別研究不同乙醇溶液濃度（30%、40%、50%、60%、70%、80%），不同溫度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃），不同提取時間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h），不同液固比（7.5∶1、10∶1、12.5∶1、15∶1、17.5∶1、20∶1）（mL/g）對類黑素濃度的影響，用以確定正交實驗的因素水平。

1.5正交實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、提取時間、液固比、提取溫度作為影響因素，進行4因素3水平L9（34）的正交實驗，通過正交實驗確定類黑素的最佳提取工藝，因素水平編碼表見表1。

1.6數(shù)據(jù)處理

表1　正交實驗因素水平編碼表

所有的實驗均重復(fù)3次，結(jié)果以平均數(shù)表示，利用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1提取溫度對類黑素濃度的影響

稱取4.000 g大曲粉，分別加入等體積的濃度為60%的乙醇水溶液50 mL，分別在30℃、40℃、50℃、60℃條件下水浴加熱并不斷攪拌，3 h后，離心取上清液，將其濃縮，再用50 mL容量瓶進行定容，于470 nm處測吸光度，考察不同提取溫度對類黑素濃度的影響，結(jié)果見圖1。

圖1　不同提取溫度對類黑素濃度的影響

由圖1可以看出，隨著提取溫度的上升，類黑素濃度逐漸上升。用SPSS軟件進行單因素分析，用Duncan法進行兩兩比較，取α=0.05時，sig＜0.01，組間差異極顯著，提取溫度對類黑素濃度的影響極顯著。20℃、30℃、40℃、50℃、60℃間差異顯著，各成一類子集。最終選擇60℃作為提取溫度的中間水平進行正交實驗。

2.2乙醇濃度對類黑素終濃度的影響

稱取4.000 g大曲粉，分別加入等體積的濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇水溶液50 mL，在60℃條件下水浴加熱并不斷攪拌，3 h后，離心取上清液，將其濃縮，再用50 mL容量瓶進行定容，測定在470 nm處吸光度，考察不同乙醇濃度溶液對類黑素濃度的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，隨著乙醇濃度的增加，類黑素濃度先上升后下降，當(dāng)乙醇濃度為40%時達到最高點。用SPSS軟件進行單因素分析，用Duncan法進行兩兩比較，取α=0.05時，sig＜0.01，組間差異極顯著，乙醇濃度對類黑素濃度的影響極顯著。50%、60%差異顯著，各成一類子集；30%、40%間差異不顯著，歸為同類子集；70%、80%間差異不顯著，歸為同類子集。最終選擇30%作為乙醇溶液濃度因素的中間水平進行正交實驗。

2.3提取時間對類黑素濃度的影響

稱取4.000 g大曲粉，分別加入等體積的濃度為60%的乙醇水溶液50 mL，在60℃條件下水浴加熱并不斷攪拌，分別在1 h、2 h、3 h、4 h、5 h后離心，取上清液，將其濃縮，再用50 mL容量瓶進行定容，測定在470 nm處吸光度，考察不同提取溫度對類黑素濃度的影響，結(jié)果見圖3。

圖2　不同乙醇濃度對類黑素濃度的影響

圖3　不同提取時間對類黑素濃度的影響

由圖3可知，隨著提取時間的延長，類黑素濃度逐漸升高至基本保持不變，提取時間為3 h時達到最高。3 h后基本保持不變，說明在提取3 h后，類黑素基本溶出完全。用SPSS軟件進行單因素分析，用Duncan法進行兩兩比較，取α=0.05時，sig＜0.01，組間差異極顯著，提取時間對類黑素濃度的影響極顯著。1 h和2 h和3 h和4 h、5 h間差異顯著，各成一類子集，其中4 h、5 h間差異不顯著，歸屬同類子集。最終選擇3 h作為提取時間因素的中間水平進行正交實驗。

2.4液固比對類黑素濃度的影響

稱取4.000 g大曲粉，分別按液固比為7.5∶1、10∶1、12.5∶1、15∶1、17.5∶1、20∶1（mL/g）加入相應(yīng)體積的濃度為60%的乙醇水溶液，在60℃條件下水浴加熱并不斷攪拌，3 h后，離心取上清液，將其濃縮，再用50 mL容量瓶進行定容，測定在470 nm處吸光度，考察不同液固比對類黑素濃度的影響，結(jié)果見圖4。

圖4　不同液固比對類黑素濃度的影響

由圖4可知，隨著單位質(zhì)量提取溶液體積增加，類黑素濃度先升高再下降，在液固比為15∶1（mL/g）時達到最高。用SPSS進行單因素分析，用Duncan法進行兩兩比較，取α=0.05時，sig＜0.01，組間差異極顯著，表明液固比對類黑素濃度的影響極顯著。7.5∶1和10∶1和12.5∶1、15∶1和17.5∶1和20∶1（mL/g）間差異顯著，各成一類子集。最終選擇15∶1（mL/g）作為液固比因素中間水平進行正交實驗。

2.5正交實驗設(shè)計與優(yōu)化

按1.6節(jié)方案進行正交實驗。正交實驗設(shè)計及直觀分析結(jié)果見表2。

表2　正交實驗設(shè)計及結(jié)果分析

由表2可知，在影響類黑素濃度的提取溫度、乙醇濃度、提取時間和液固比這4個因素中，影響大小的次序為液固比＞乙醇濃度＞提取時間＞提取溫度。從表2中可選擇的最優(yōu)組合為A3B3C2D3，與用SPSS軟件分析得出的結(jié)果一致，即優(yōu)選的組合條件為：提取溫度70℃，乙醇濃度40%，提取時間3 h、液固比17.5∶1（mL/g）。用優(yōu)化后的條件進行驗證實驗，最終類黑素濃度達到3.01 mmol/L，高于正交實驗的任一實驗組，表明優(yōu)化后的組合條件是可用于后續(xù)的大批量提取的。

3　結(jié)論

本研究通過單因素及正交實驗，確定了醬香型大曲中類黑素提取的最優(yōu)工藝條件。得到的最優(yōu)工藝條件為：提取溫度70℃，乙醇濃度40%，提取時間3 h以及液固比17.5∶1（mL/g）。在此條件下從醬香型大曲中提取得到的類黑素濃度最高。目前關(guān)于大曲質(zhì)量分級的研究較為少見，本研究找到一種能夠表征大曲質(zhì)量的指標(biāo)，為后續(xù)的醬香型大曲的質(zhì)量分級奠定了基礎(chǔ)，關(guān)于醬香型大曲質(zhì)量分級的深入研究有待進行。

美拉德反應(yīng)屬于非酶促褐變反應(yīng)［13］，世界上比較公認的美拉德反應(yīng)機理是由Hodge提出的［14］，美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類繁多，現(xiàn)今研究得較多也較清楚的是糖基化最終產(chǎn)物和類黑素［15］。類黑素是指碳水化合物（一般指糖類）與帶有自由氨基的含氮化合物（如氨基酸、肽、蛋白質(zhì)等）之間發(fā)生美拉德反應(yīng)后期形成的一種棕褐色物質(zhì)，它是由多種結(jié)構(gòu)和不同分子量的多種物質(zhì)組成的復(fù)雜混合物，而且褐變的原料以及反應(yīng)條件均是類黑素組成的影響因素［16］。目前，人們對食品顏色的形成機理還不完全了解，而對類黑素的結(jié)構(gòu)更是知之甚少。因此，不同原料里類黑素的結(jié)構(gòu)不盡相同，找到醬香型大曲類黑素的最佳提取工藝尤為關(guān)鍵，從醬香型大曲中提取出的類黑素可做進一步的深入研究，包括類黑素的理化性質(zhì)、成分組成等。

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優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-04-25；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160425.1423.011.html。

中圖分類號：TS262.3；TQ925.7

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）07-0051-04

DOI：10.13746/j.njkj.2016045

基金項目：白酒質(zhì)量安全可追溯系統(tǒng)的發(fā)展現(xiàn)狀對策研究（2015ZR0181）。

收稿日期：2016-02-18

作者簡介：徐延，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail：xy7217@126.com。

通訊作者：羅愛民。

Optimization of the Extraction Technology of Melanoidins from Jiangxiang Daqu by Orthogonal Test

XU Yan1，JIANG Yingli2，CHENG Wei2，LI Weijie1，MENG Zikuan1，GAO Hong1and LUOAimin1
（1.Department of Food Engineering，Sichuan University，Chengdu，Sichuan 610064；2.Langjiu Group Co.Ltd.，Gulin，Sichuan 618200，China）

Abstract:To optimize the extraction technology of melanoidins from Jiangxiang Daqu，L9（34）orthogonal design was adopted with Jiangxiang Daqu as the extracting material and ethanol solution as the extracting solvent.The effects of extraction temperature，ethanol solution concentration，extraction time and liquid-solid ratio on melanoidins concentration were investigated through single factor experiment.The results showed that，the effects of extraction temperature，ethanol solution concentration，extraction time and liquid-solid ratio on melanoidins concentration were significant，and their influencing degree ranked in decreasing sequence as liquid solid ratio＞ethanol solution concentration＞extraction time＞extraction temperature.The optimium extracting parameters of malanoidins from Jiangxiang Daqu were summed up as follows:extraction temperature was at 70℃，ethanol solution concentration was 40%，extraction time was 3 h，and liquid-solid ratio was 17.5∶1.

Key words:Daqu；melanoidins；orthogonal experiment；extraction technology